水貂脑炎链球菌的分离鉴定与药敏试验

秦绪伟 王景伟 张丹

水貂脑炎链球菌的分离鉴定与药敏试验

秦绪伟 王景伟 张丹

（齐鲁动物保健品有限公司 山东 济南 250100）

本试验对山东日照某水貂养殖场的水貂死亡病例进行了临床判断，经实验室的染色镜检、细菌分离、生化试验确诊为链球菌。经药敏试验，选择敏感性高的药物进行治疗，最终控制了病情。

水貂 脑炎 链球菌 鉴定 药敏

链球菌在自然条件下广泛存在，是一种人兽共患传染病病原[1]，可以感染多种毛皮动物和家畜[2]，主要表现为严重的急性败血性疾病。水貂链球菌病多散发或者地方性流行[3]，临床症状为头颈部的肿胀，尖叫、摇头晃脑。病原为C型兽疫链球菌，可以通过呼吸道和消化道传播[1]。链球菌环境中常存在，各种动物在应激条件下容易患病，一年四季都有发生，但是在炎热的夏季发病最多，特别是水貂分窝前后，发生较多，成为养殖场防不胜防的疾病。传染源主要是被污染的笼子、用具、垫草等[4]。

2019年6月，山东某水貂养殖场，养殖水貂4000只，60日龄左右，大群精神良好、食欲、饮欲正常，发病呈现散发症状，有的摇头晃脑、尖叫，严重的吃食困难，慢慢消耗，有的瘫痪、急性死亡。养殖场自行投药复合维生素B、葡萄糖3d，效果不佳，发病持续增加，从每天发现1~2只，慢慢发展每天5~7只，畜主带病貂来实验室化验，经临床诊断、实验室的分离培养鉴定为链球菌，经药敏试验，最终控制了病情。

1 材料和方法

1.1 试验菌株 山东日照一养殖场，发生水貂摇头晃脑的症状，畜主带2只病貂到实验室请求化验，经实验室的化验，无菌从脑分离到一株细菌，作为试验菌株。

1.2 器材 电热恒温培养箱，上海精宏DNP-9162型；洁净工作台，苏州安泰SW-CJ-2FD型；生物显微镜，奥林巴斯CX-31型；电磁炉，半球电器；立式蒸汽灭菌器，上海申安LDZX-75KBS型；细菌微量生化反应小管，购自北京路桥技术股份有限公司；营养琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、疱肉培养基，购自青岛海博试剂公司；药敏片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；牛血清，购自山东劲牛生物科技股份试剂公司；犬瘟热、细小病毒试纸，购自韩国安捷。其他实验室常用器具：解剖台、解剖剪、手术刀、酒精灯、接种环、培养皿等。小白鼠，购自山东大学试验动物中心；水貂，购自山东旭升养殖专业合作社。

1.3 细菌分离 无菌条件下开启水貂的脑颅，将脑进行触片，革兰氏染色后显微镜镜检。无菌取肝脏、脑组织、心血进行细菌分离，接种血清琼脂平板、巧克力琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂平板，37℃温箱培养24h，观察细菌细菌生长情况，若有细菌生长，涂片镜检。无菌取肝脏、脑组织，接种厌气肉干汤培养基，37℃温箱培养18h，观察有无气泡产生。

1.4 病毒检测 取眼、鼻内容物，按说明处理，滴加到犬瘟热试纸；取肛拭子，按说明处理，滴加到细小病毒试纸，静止3min后，观察检测结果。无菌取脑、脾脏、淋巴结1:10加生理盐水研磨，进行PCR基因扩增，检测犬瘟热、细小病毒、阿留申病毒。

1.5 生化试验[5]无菌取脑部组织进行细菌分离，接种血清平板，根据不同说明要求37℃温箱培养18~72h，取血清平板分离的细菌，接种加2%血清马丁肉汤液体培养基，接种后18h取样0.2ml培养液，接种微量生化反应小管葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、棉实糖、水杨苷、山梨醇、甘露糖、菊糖等，进行触酶试验。

1.6 16S rRNA 取马丁肉汤培养基培养的分离菌，使用裂解法进行细菌总DNA的提取，细菌适量放入1.5ml离心管，12000r/min离心1min，去掉上清液，使用无菌水重悬，摇匀后沸水7min，再冰浴5min，上清作为基因模板。设计引物，基因扩增16S rRNA，PCR反应，PCR产物送交测序。根据测序结果，与Genbank进行对比，16S rRNA以相似性97%以上为界限确定为何种细菌。

1.7 溶血性鉴定 无菌取脑部组织接种2%血清平板培养基，37℃温箱培养24h，挑取单个菌落接种鲜血琼脂平板，37℃温箱培养24h，观察菌落周边情况。

1.8 药敏试验 取血清平板分离的脑部细菌菌落，均匀地涂布在营养血清平板，将不同的药敏片贴于平板上，温箱37℃培养24h，观察记录不同药物敏感程度结果。

1.9 毒力试验 取血清平板分离的脑部细菌，接种马丁肉汤培养基，接种后在温箱37℃培养18h，腹腔接种16~18g小白鼠5只，0.5ml/只，同时设空白对照不接种小鼠3只，接种后观察7d，记录小鼠死亡情况。腹腔接种2月龄水貂3只，2ml/只，观察有无瘫痪、摇头等神经症状，同时设空白对照不接种水貂2只，接种后观察15d，观察记录水貂发病情况。

2 结果

2.1 细菌分离和培养特性结果 无菌取水貂脑部组织，在载玻片上触片，革兰氏染色，镜检可见阳性球菌，单个或者几个排列。取心血、肝脏、脑组织，接种培养基后，37℃温箱培养24h，可见血清琼脂平板、巧克力琼脂有露珠样透明小菌落，SS琼脂、麦康凯琼脂平板不生长。血清平板和巧克力平板细菌显微镜镜检，可见革兰氏阳性球菌。

2.2 病毒检测结果 犬瘟热试纸、细小病毒试纸，检测结果都为阴性。无菌取脑组织、肝脏按照1:10加PBS研磨，进行PCR基因扩增，检测犬瘟热、细小病毒、阿留申病毒阴性。

2.3 生化试验结果 分离的细菌发酵分解葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、棉实糖、水杨苷，不分解山梨醇、甘露糖、菊糖，触酶试验阴性(见表1)。

表1 分离菌生化鉴定结果

2.4 16S rRNA结果 裂解法提取细菌总DNA，把PCR产物送测序公司进行测序，测序后进行基因比对，最终确定分离菌为2型链球菌。

2.5 溶血性鉴定结果 无菌取脑部组织接种2%血清平板培养基，37℃温箱培养24h，挑取单个菌落接种鲜血琼脂平板，37℃温箱培养24h，观察平板明显的细小露珠样菌落，周边有明显的溶血环，属于乙型溶血。

2.6 药敏试验结果 使用药敏纸片法对分离菌进行药敏实验，经检测头孢喹肟、阿莫西林、头孢噻呋、丁胺卡那霉素高敏，恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星低敏，强力霉素、粘杆菌素、氟苯尼考、壮观霉素不敏感(见表2)。

表2 分离菌的药敏结果 (mm)

2.7 毒力试验结果 分离的细菌，接种马丁肉汤培养基培养后，腹腔接种16~18g小白鼠5只，3~4日全部发病死亡，对照组观察7日正常健活。腹腔接种2月龄水貂3只，4~7d可见瘫痪、摇头、尖叫等神经症状，对照组观察15d正常健活。

3 讨论

（1）链球菌种类很多，自然界存在于水、土壤、尘埃、动物体表、消化道、生殖黏膜、乳汁等[6]，有的是动物体内正常的菌群，有的是致病性菌，恶劣条件会促进疾病的发生，可以引起化脓、肺炎、脑炎等疾病。毛皮动物的链球菌性脑炎主要是溶血性链球菌感染分窝断奶期水貂、狐狸，其他生长期间水貂、狐狸散发，很少有群发或者大规模爆发的病例。（2）水貂链球菌性脑炎，常见于断奶期水貂，主要是由溶血性链球菌感染，引起水貂的急性死亡，尖叫、瘫痪、摇头晃脑，慢性病例也因为瘫痪或者头部摇晃无法进食而死亡。发生水貂的瘫痪、尖叫病例，可以初步诊断为水貂脑炎，但是病毒、细菌、维生素缺乏、寄生虫都可以水貂脑炎，需要进行具体鉴别诊断。病毒性脑炎多爆发或者大规模群发，难以治疗，病毒分离或者基因检测可以诊断；细菌性脑炎，多散发，临床症状明显，药物治疗有效果，细菌分离或者镜检基本可以诊断；维生素缺乏性脑炎，主要是VB1缺乏，个别发生，不死亡，瘫痪后饮食障碍，最后消瘦死亡；寄生虫性脑炎，发生较少，主要发生于饲喂淡水鱼的养殖场，未煮熟，感染寄生虫，侵害脑部引发脑炎。发生脑炎疾病，可以根据临床症状初步诊断，或者药物治疗性诊断，一般可以诊断，具体确诊需要实验室的检测。（3）水貂发生疾病，及时进行实验室诊断，确诊后注意环境消毒，饲料饮水卫生，选择敏感性高的药物及时治疗，综合治理。此次病例，零散发生，临床初步诊断脑炎，经实验室的细菌分离鉴定，最终确定为链球菌感染，经药敏试验，结合临床实际，全群投药口服阿莫西林和卡巴匹林钙，发病水貂注射头孢喹肟和氟尼辛谱甲胺，3d后发病稳定，7d后全群正常。

[1] 夏咸柱. 野生动物疫病学[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011, 724-729.

[2] 钱爱东. 兽医全攻略-毛皮动物疾病[M]. 北京: 中国农业出版社, 2009, 304-308.

[3] 闫新华. 毛皮动物疾病诊疗原色图谱[M]. 北京: 中国农业出版社, 2008, 64.

[4] 孙卫东. 貂病诊疗与处方手册[M]. 北京: 化学工业出版社, 2008, 58-59.

[5] 周庭银. 临床微生物学诊断与图解(第2版)[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2006, 97-98.

[6] 陆承平. 兽医微生物学(第5版)[M]. 北京: 中国农业出版社, 2013, 204-212.

（2019–08–03）

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