米诺环素对黑质急性炎症的保护作用及与自噬相关性研究

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种常见的神经系统退行性疾病，其病因尚未完全明确，研究表明，免疫/炎症机制参与了PD的发病[1]。小胶质细胞是脑内主要的免疫/炎症细胞，小胶质细胞的激活，是PD等神经退行性疾病的共同病理生理机制。黑质部位小胶质细胞的数量是脑内其他部位的4.5倍，因此该部位对炎症刺激更为敏感，一旦小胶质细胞的过度激活呈慢性、持续性状态，就会分泌出大量的促炎因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-β(IL-β)、一氧化氮(NO)等，最终导致该部位多巴胺神经元细胞严重受损甚至死亡[1]。受伤的神经元细胞同时还生成一些物质，如α-突触核蛋白(α-synuclein)[2]，其病理性蓄积的发生早于多巴胺神经元的死亡，而细胞自噬功能障碍是导致α-synuclein清除障碍和异常积聚的重要因素[3-4]。随着对自噬应激认识的深入，日益认识到单纯的自噬激活并不能对α-synuclein 病理性蓄积引起的多巴胺能神经元死亡发挥保护作用，若自噬诱导与自噬降解之间失平衡反而可能会加剧神经元损伤。

四环素类抗生素是一类广谱碱性抗生素，其半合成有多西环素和米诺环素(minocyclein)等。早已有研究发现，米诺环素能通过血脑屏障，在脑脊液和中枢神经系统中有很高的血药浓度，且具有显著的神经保护作用[5]。目前对米诺环素的神经保护研究主要集中在神经炎症的调控和神经元凋亡这两方面[6]，有关α-synuclein降解和自噬/溶酶体方面尚无深入研究。动物模型研究证实，脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)单次腹腔注射能引起黑质部位急性炎症反应，小胶质细胞持续活化，出现慢性、进行性加重PD样的病理改变[7]。本研究利用这一PD模型，就米诺环素对黑质急性炎症、α-synuclein降解和自噬功能障碍的影响进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级C57BL 3月龄雄性小鼠，体质量250～280 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[许可证号：SCXK(沪)2003-0003]。小鼠在SPF级动物房饲养[SYXK(苏)2005-0001]。饲养密度4只/盒，温度(24±1) ℃，相对湿度(70±4)%，自由摄食与饮水，自动光控12 h明暗周期。

1.2 药品与试剂 LPS、米诺环素、兔抗α-synuclein抗体购自Sigma 公司；羊抗Iba-1抗体、兔抗LC3抗体购自Abcam 公司；兔抗HDAC6抗体购自Bioworld 公司；兔抗p62抗体购自ZNEO公司；小鼠单克隆β-actin抗体购自Santa Cruz公司；Western及IP细胞裂解液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；普通二抗购自Jackson ImmunoResearch公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3 动物的分组和给药 所有小鼠被随机分为7组：(1)对照组；(2)单独LPS组；(3)75 mg M+LPS组；(4)50 mg M+LPS组；(5)25 mg M+LPS组；(6)单独75 mg M组；(7)单独 50 mg M组(75 mg M、50 mg M、25 mg M分别代表75 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg米诺环素)。单独或联合使用米诺环素干预的组别按对应的米诺环素剂量连续给药3次，分别为LPS注射前2 d、1 d和1 h；对照组和单独LPS组给予50 mg/kg生理盐水注射。所有LPS处理组小鼠单次腹腔注射LPS 5 mg/kg，对照组和单独米诺环素组小鼠给予同等剂量的生理盐水。

1.4 行为学测试 分别在LPS注射前1 d、注射后1 d对各组动物进行行为学测试。每次测试的顺序是随机的，检测时间均选在开始光照后的2 h。所有行为学检测均在一恒温、固定布局、安静并光照充分的房间进行，固定由2名实验者进行，一人负责仪器操作，另一人负责记录。

爬杆试验：爬杆时间是反映小鼠运动功能的良好行为学指标，能综合评价动物运动能力。自制小鼠爬杆，为一根竖直圆杆，直径8 mm，高度70 cm，表面缠敷医用胶布以防滑，并标有刻度。测试前引导、训练小鼠从杆顶向下爬至杆底平面2次，测试时将小鼠头端向下置于杆顶，记录小鼠从50 cm高度爬至杆底平面的时间作为小鼠爬杆所需时间，每只小鼠测3次，每次间隔5 min。小鼠中途如出现调头、停滞不前或直接跃下均视为无效结果，需重新测试。

1.5 免疫组化法观察小胶质细胞变化 脱颈法迅速断头取脑，并切取黑质相应区域(Bregma-2.8至Bregma-3.8)组织，以SP法行免疫组织化学检测，滴加所需的一抗(Iba-1为1：100)，空白对照组用磷酸盐缓冲液代替一抗，置4℃冰箱过夜后滴加二抗，DAB显色剂显色，适时终止显色反应，封固。光镜下计数所有包含黑质区域的切片中Iba-1阳性细胞的个数，累计每例所有切片计数之和，并观察形态学变化。

1.6 免疫印迹法测定自噬相关蛋白含量 脱颈法迅速断头取脑,并切取黑质相应区域(Bregma-2.8至Bregma -3.8)组织存于-80 ℃冰箱，选取腹侧中脑相应黑质部位的组织，按10 mg/mL加入裂解液制成匀浆，冰浴静置30 min，离心取上清总蛋白质，以磷酸缓冲盐溶液将各样品蛋白稀释至相同浓度后，采用免疫印迹法(Western blot法)测定α-synuclein和自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62和HDAC6蛋白表达量。

2 结果

2.1 行为学结果 LPS注射后1 d与对照组相比，LPS处理组小鼠爬杆速度减慢(P<0.01)；其中，与单独LPS组相比，75 mg M+LPS组小鼠爬杆速度进一步减慢(P<0.05)，而25 mg M+LPS组及50 mg M+LPS组爬杆速度较LPS组则显著提高(P<0.01)；与此同时，单独米诺环素组(包括75 mg M组和50 mg M组)爬杆速度较对照组无显著变化(P>0.05)。见图1。

注：与对照组比较，**P<0.01；与单独LPS组比较，#P<0.05，##P<0.01图1 小鼠爬杆速度变化(n=10)

2.2 LPS注射后1 d各组小鼠黑质部位炎症反应变化 与对照组相比，LPS处理组小鼠黑质部位出现大量活化的小胶质细胞，单独米诺环素(包括75 mg M和50 mg M)组小鼠黑质部位也出现极少量活化的小胶质细胞。与LPS组相比，25 mg M+LPS组和50 mg M+LPS组小鼠黑质部位活化的小胶质细胞数量均有所减少，而75 mg M+LPS组小鼠黑质部位活化的小胶质细胞数量有所增加。见图2。

2.3 黑质部位α-synuclein蛋白水平变化 与对照组相比，LPS组和75 mg M+LPS组小鼠黑质部位α-synuclein蛋白水平显著增加(P<0.01)，25 mg M+LPS组和50 mg M+LPS组无明显变化(P>0.05)；75 mg M及50 mg M组小鼠黑质部位α-synuclein蛋白水平与对照组相比，差异亦无统计学意义(P>0.05)。与LPS组相比，75 mg M+LPS组小鼠黑质部位α-synuclein蛋白水平显著增加(P<0.05)，而25 mg M+LPS和50 mg M+LPS组小鼠黑质部位α-synuclein蛋白水平则较LPS组明显下降(P<0.01)。见图3。

2.4 黑质部位自噬相关蛋白表达

2.4.1 LC3-Ⅱ蛋白表达水平变化：与对照组相比，LPS组和75 mg M+LPS组小鼠黑质部位LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著提高，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS组小鼠的LC3-Ⅱ蛋白表达水平也提高(P<0.001)，75 mg M组小鼠黑质部位LC3-Ⅱ蛋白水平也出现少量增加(P<0.05)，50 mg M组无明显变化(P>0.05)。与LPS组相比，75 mg M+LPS组小鼠黑质部位LC3-Ⅱ蛋白表达水平进一步增加(P<0.05)，而25 mg M+LPS和50 mg M+LPS组小鼠黑质部位LC3-Ⅱ蛋白水平显著下降(P<0.01)。见图4。

图2 小鼠黑质部位小胶质细胞(Iba-1)，30 μm

注：与对照组比较，**P<0.01；与LPS组比较，#P<0.05，##P<0.01图3 小鼠黑质部位α-synuclein蛋白表达变化(n=4)

注：与对照组比较，*P<0.05，***P<0.001；与LPS组比较，#P<0.05，##P<0.01图4 小鼠黑质部位LC3-Ⅱ蛋白表达变化(n=4)

2.4.2 p62蛋白表达水平变化：与对照组相比，LPS组和75 mg M+LPS组小鼠黑质部位p62蛋白水平显著增加(P<0.001)，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS组小鼠无明显变化(P>0.05)；与LPS组相比，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS组小鼠黑质部位p62蛋白水平明显下降(P<0.001)。见图5。

2.4.3 HDAC6蛋白表达水平变化：与对照组相比，LPS组和75 mg M+LPS组小鼠黑质部位HDAC6蛋白水平显著增加(P<0.001)，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS组小鼠轻度增加(P<0.01)；与LPS组相比，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS组小鼠黑质部位HDAC6蛋白水平明显下降(P<0.001)。见图6。

3 结论

注：与对照组比较，***P<0.001；与LPS组比较， ###P<0.001图5 小鼠黑质部位p62蛋白表达变化(n=4)

注：与对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；与LPS组比较，###P<0.001图6 小鼠黑质部位HDAC6蛋白表达变化(n=4)

目前PD的病因尚不明确，黑质多巴胺能神经元变性坏死和α-synuclein的异常积聚是PD的主要病理特征。神经炎症是所有神经退行性疾病的共同病理机制，受损神经元和炎症反应之间存在着自我推进式的恶性循环，任何能打破该恶性循环的治疗都应该可以延缓该类神经疾病的进展。基因学分析提示，许多炎症因子的DNA多态性是PD的危险因素[8]；抗炎药物能降低小胶质细胞的活性，减少促炎症因子的分泌，各国学者纷纷致力于寻找合适的药物调控促炎因子的生成，从而在神经退行性疾病的治疗中发挥神经保护作用[5,7]。

本研究表明，25 mg/kg、50 mg/kg米诺环素干预能明显改善PD模型小鼠的急性运动障碍，减轻黑质部位的急性炎症反应，在一定程度上打破黑质部位受损多巴胺神经元和炎症反应之间自我推进式的恶性循环，有可能延缓多巴胺神经元的进行性缺失。PD的发病与多种机制有关，其中α-synuclein清除受损和自噬功能障碍是其中重要的一环。分泌至胞外的α-synuclein不仅会造成周围神经元的损伤[9]，还可以激活周围胶质细胞导致神经炎症的发生[10]。因此，能够激活自噬的药物可通过促进α-synuclein清除来延缓疾病进展[11]。本研究在证实了米诺环素的抗炎症作用同时，研究了小鼠黑质部位α-synuclein蛋白水平变化，发现25 mg/kg、50 mg/kg米诺环素的预处理亦能缓解PD小鼠黑质部位α-synuclein的异常聚集。因此，笔者有理由推测米诺环素可能通过减少α-synuclein的积聚而延缓PD的进程。

细胞自噬普遍存在于真核细胞中，是细胞通过自身形成的囊泡，吞噬胞浆内变性蛋白质和细胞器，维持细胞稳态的过程[12]。在病理状态或老化状态下，将出现自噬激活和降解两者间的失衡，导致错误折叠蛋白在体内的积聚，细胞自噬功能障碍参与了PD的发生。研究表明，四环素类抗生素米诺环素和替加环素具有诱导自噬的功能[13-14]，米诺环素可以通过AMPKα1信号介导的自噬抑制辐射诱导神经元凋亡[15]。有研究者在PD病人的大脑黑质中检测到了空泡样的自噬体，并且观察到了LC3-Ⅱ的表达上调[16]。自噬的激活可能是有利于神经元存活的保护性反应，但是过度激活将导致神经元的死亡[17-18]。自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、HDAC6和p62三者与自噬的发生密切相关，本研究发现25 mg/kg、50 mg/kg米诺环素干预组PD小鼠黑质部位LC3-Ⅱ、HDAC6蛋白表达下降，自噬底物p62蛋白的表达量也出现同步下降，结合上述对实验小鼠相同部位α-synuclein蛋白表达量的检测结果分析，可以合理推测PD模型小鼠黑质部位的自噬应激在25 mg/kg、50 mg/kg米诺环素预干预下有所缓解，自噬激活和降解间的失衡有所好转。

本研究结果显示，75 mg M+LPS米诺环素干预组中LC3-Ⅱ、HDAC6的蛋白表达量较单独LPS组进一步增加，而且自噬产物p62和α-synuclein的水平也出现同步增加。与此同时，单独75 mg/kg米诺环素组实验小鼠黑质部位的LC3-Ⅱ蛋白表达水平较对照组也有所增加，这一结果提示，高剂量的米诺环素可能存在某种机制导致自噬的过度激活，需要在后期的实验中继续观察及深入研究。另一方面也提示，单纯激活自噬很可能是无效的，甚至是有害的，维持自噬激活和底物降解之间的平衡，促进底物的降解可能具有更好的神经保护作用。

综上所述，低、中剂量的米诺环素可保护LPS所致的小鼠黑质多巴胺能神经元损伤，减轻系统性炎症所致黑质部位的急性炎症反应，平衡过度激活的自噬功能，促进α-synuclein自噬性清除可能是其有效的作用机制。因此，米诺环素是PD治疗的一个非常有潜力的靶点药物，其在临床应用中的可行性、有效性和安全性等问题则需要更多及更深入的研究。