氨和空气暴露对大鳞副泥鳅血浆皮质醇、乳酸及血糖含量的影响

2019-11-27丁淑荃谢云轶毛颖睿王光毅董昭然张云龙

淡水渔业 2019年6期

丁淑荃，陈范，马欢，谢云轶，毛颖睿，王光毅，金慧，董昭然，张云龙

(安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036)

氨对水生动物具有极强的毒性[1]，而一些气呼吸型鱼类，如泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)[2]、大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)[3-5]等，可耐受非常高的体内或体外氨。其主要原因是这些气呼吸型鱼类具有一些特殊的氨耐受策略[1,6]。尽管如此高浓度的体内或体外氨并不能对这些气呼吸型鱼类造成致死效果，但仍旧会引起强烈的应激反应。当动物处于某种不良条件下会引起应激反应，从而在表观水平或生理水平上影响其完整性[7]。通常来说，应激会对鱼类造成多种不良反应，如降低生长速度[8]、形态学变化[9]、降低免疫力[10]及改变生理生化指标[11]等。相较于陆生动物，鱼类所面临的应激因子更为广泛，包括物理(如运输、装载及捕捞)[12-13]和环境(如拥挤、低氧、污染物、温度、盐度及营养不良)[10,14-16]因子。生理学响应是鱼类中最常用的应激评价指标。其中，血浆皮质醇、血糖及乳酸含量是最常用的评价指标[11-12,17]。

大鳞副泥鳅是东亚地区重要的特种养殖品种之一[18-19]，据中国渔业统计年鉴(2019)报道，我国2018年度泥鳅(包括泥鳅、大鳞副泥鳅和台湾泥鳅)的养殖总产量为35.84万吨，总产值约为71.68亿元[20]。自然条件下，其栖息于浅水区域且经常面临阶段性的干旱环境。当栖息地缺水时，大鳞副泥鳅会钻入湿润的泥土中，以后肠作为辅助呼吸器官，直接呼吸空气[21]。在这种条件下，大鳞副泥鳅首先需要解决的问题应该是体内氨的累积。前期研究结果表明大鳞副泥鳅具有几种独特的氨耐受策略以应对过高的体内或体外氨累积[3,5]。然而，大鳞副泥鳅对高浓度环境或体内氨的应激相应仍不清楚。因此，本研究旨在阐明大鳞副泥鳅对高浓度环境和体内氨的生理相响应，为大鳞副泥鳅适应体内外氨累积的机制提供理论依据。

1 材料方法

1.1 试验鱼

试验用大鳞副泥鳅(25±4)g由合肥市周边的水产养殖场获得。试验鱼运至实验室后暂养于60 L的水族箱中(盛水50 L)，实验开始前暂养7 d，实验期间室温24～26 ℃。暂养期间内，每天换水，换水量为30%左右，养殖用水在实验室内曝气96 h，水温与室温相同，水族箱每天连续充气，每天投喂两次商品饲料(粗蛋白35%，粗脂肪7%)。实验开始前24 h停止投饵。

1.2 实验设计

实验设置空气暴露组、氨暴露组和对照组3个组。将大鳞副泥鳅置于圆形塑料盆(直径35.5 cm，高15.5 cm)中进行空气暴露，盆中装有很薄的一层蒸馏水(100 mL)以保持大鳞副泥鳅体表湿润，盆中的蒸馏水每隔8 h彻底更换一次以保证盆中的湿度。将大鳞副泥鳅置于圆形塑料盆(直径35.5 cm，高15.5 cm)中，盆中装有10 L 30 mmo/L的NH4Cl溶液(以4 mol/L NaOH溶液调节pH至7.2)，以此进行氨暴露，盆中的NH4Cl溶液每隔24 h彻底更换一次以避免氨挥发造成的氨浓度降低。将4尾大鳞副泥鳅置于圆形塑料盆(直径35.5 cm，高15.5 cm)中，盆中装有10 L 曝气后的蒸馏水，以此作为对照组，盆中蒸馏水每隔24 h彻底更换一次。3个组的暴露时间均设置为0、12、24、 48、72及96 h，每个暴露时间点均设置三个平行组，每个平行放置4尾鱼。实验期间，实验室内温度为(24±1)℃，所有试验用水均在实验室内静置96 h以上，以保证水温与室温一致。

1.3 样品采集及处理

每个暴露时间点结束，该时间点三个平行中的所有试验鱼均以MS-222彻底麻醉。随后以1 mL注射器从尾静脉取血，置于肝素钠润洗过的抗凝管中。取血后，在离心力4 000g、温度4 ℃的条件下离心30 min，取上清液制备血浆。每个平行中的血浆由4尾试验鱼合并而来。所有样品均保存于-80 ℃的冰箱中待测。

1.4 生理指标检测

血浆皮质醇含量以酶联免疫法通过商业试剂盒测定(no.H094,Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute,China)，反应温度为37 ℃，检测波长为450 nm，以酶标仪(华东电子DG5033A)检测，单位为mmol/L。血糖和血浆乳酸含量通过商业试剂盒(no.F006 and A019-2,Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute,China)测定，反应温度均为37 ℃，检测波长分别为505 nm和530 nm，以紫外可见分光光度计检测，单位均为mmol/L。

1.5 数据处理

所有数据均以平均值±标准差表示，数据分析以SPSS 18.0 (SPSS Inc.Chicago,IL,USA)进行。先以Levene’s检验进行方差同质性检验，随后进行单因素方差分析(ANOVA)检测结果的显著性水平，如果显著则进行Duncan’s多重比较。以t-检验分析同一时间点试验组与对照组之间的显著性。显著性水平为α=0.05。

2 结果

2.1 血浆皮质醇水平

不同时间氨和空气暴露后，大鳞副泥鳅血浆中皮质醇含量的变化如图1所示。氨和空气暴露显著影响大鳞副泥鳅血浆皮质醇含量。氨暴露大鳞副泥鳅24 h内，其血浆皮质醇含量显著增加，随后则显著下降，氨暴露72～96 h后血浆皮质醇含量保持基本稳定。12～96 h的空气暴露后，空气暴露组中血浆皮质醇含量均显著高于对照组。相似地，氨暴露大鳞副泥鳅12 h内，其血浆皮质醇含量也呈现显著增加的趋势，随后则显著下降，至72 h后则降至对照组水平。氨暴露12、24和48 h后，氨暴露组中血浆皮质醇含量显著高于对照组。

图1 空气和氨暴露对大鳞副泥鳅血浆皮质醇含量的影响Fig.1 Effects of various periods of aerial and ammonia exposure on the contents (mmol/L,n=3) of the affected cortisol in the plasma of P.dabryanus

不同大写字母表示不同时间空气暴露之间差异显著，不同小写字母表示不同时间氨暴露之间差异显著，不同阿拉伯数字表示对照组之间差异显著，*表示空气或氨暴露组与对照组之间差异显著。下同。

2.2 血糖含量

图2所示为氨和空气暴露对大鳞副泥鳅血糖含量的影响。空气暴露大鳞副泥鳅12 h内并没有显著影响其血糖含量。而空气暴露12 h后，大鳞副泥鳅血糖含量显著增加，直至试验结束。而且，在空气暴露24 h后，空气暴露组血糖水平均显著高于对照组。而氨暴露大鳞副泥鳅12 h内，其血糖含量显著增加。氨暴露12～72 h内，其血糖含量呈缓慢增加的趋势。而氨暴露大鳞副泥鳅72 h后，其血糖含量显著增加，直至试验结束。氨暴露大鳞副泥鳅12～96 h后，氨暴露组中血糖含量均显著高于对照组。

图2 空气和氨暴露对大鳞副泥鳅血糖含量的影响Fig.2 Effects of various periods of aerial and ammonia exposure on the contents (mmol/L,n=3) of the affected glucose in the plasma of P.dabryanus

2.3 血浆乳酸含量

从图3中可看出，空气暴露大鳞副泥鳅48 h内，其血浆乳酸含量的变化并不显著，但随后显著增加至稳定水平，直至试验结束。空气暴露大鳞副泥鳅72 h和96 h后，空气暴露组血浆乳酸含量显著高于对照组。而氨暴露大鳞副泥鳅则导致其血浆乳酸含量显著上升，并在暴露12 h后到达峰值。随后，血浆乳酸含量则显著降低并在暴露96 h接近对照组水平。氨暴露大鳞副泥鳅12～72 h，氨暴露组中血浆乳酸含量显著高于对照组。

图3 空气和氨暴露对大鳞副泥鳅血浆乳酸含量的影响Fig.3 Effects of various periods of aerial and ammonia exposure on the contents (mmol/L,n=3) of the affected lactate in the plasma of P.dabryanus

3 讨论

在应激状态下，血浆皮质醇和血糖含量是最常用的应激评价指标[11,22]。本研究中，氨和空气暴露显著影响大鳞副泥鳅血浆皮质醇和血糖含量，而前期大量的研究结果也得出了类似的结论。在鱼类中，神经系统感受到外界环境的变化会迅速刺激肾上腺素的分泌，随后会通过下丘脑-垂体-肾间细胞系统分泌皮质醇，从而导致血浆皮质醇含量上升[12,22-23]。应激导致的血浆皮质醇上升是非常迅速[24]的并且在应激过程中能持续保持较高水平。本研究中，大鳞副泥鳅血浆皮质醇含量在空气暴露24 h内和在氨暴露12 h内显著增加(图1)，说明体内和体外氨累积对大鳞副泥鳅造成明显的应激反应。随后，大鳞副泥鳅血浆皮质醇含量则呈现显著降低的趋势(图1)，这可能是因为大鳞副泥鳅体内的氨耐受策略开始起作用，从而促进体内皮质醇的清除。前期研究已证实大鳞副泥鳅具有几种有效的氨耐受策略[3-5]，而在其他气呼吸型鱼类中的研究也证实了这一结论的可靠性[6]。动物体内皮质醇的代谢主要在肝脏中进行[25]，且受到多种环境因素的影响，如盐度等[24]。尽管本研究中的应激因子持续至试验结束，但大鳞副泥鳅血浆皮质醇含量仍在空气或氨暴露一段时间后显著降低，甚至在氨暴露72 h后达到对照水平。本研究结果表明，大鳞副泥鳅拥有的氨耐受策略可起到抗体内或体外氨累积应激的作用。

鱼类血糖含量的上升也属于应激第一阶段[23]。这会诱导机体糖异生和糖酵解作用[22]，从而导致血糖含量上升，这一阶段被称为应激第二阶段[26]。本研究结果显示氨和空气暴露可引起大鳞副泥鳅血糖含量显著上升(P<0.05，图2)，类似的研究结果还可见于斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[11]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[16]、大西洋鲑(Salmosalar)[17]及草鱼(Ctenopharyngodonidella)[27]等。这一现象在鱼类中普遍存在，因为鱼类在应激状态下所需的能耗更多。而且，血浆皮质醇含量的上升也被证实会诱导机体血糖含量的上升[12]。然而，在虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[28]和塞内加尔鳎(Soleasenegalensis)[29]的研究中却得到了相反的结果。因此，需要精准检测出鱼类血浆基础皮质醇水平，以此来评估皮质醇上升诱导的血糖上升。另一方面，鱼类对葡萄糖利用的机制至今仍未被阐明[30]。所以，后续的研究应侧重于鱼类基础皮质醇水平的精准检测及鱼类对葡萄糖的利用机理。

乳酸是鱼类肌肉无氧代谢的产物。前期研究结果表明，鱼类在应激状态下肌肉中乳酸的生成量更大，随后会导致血浆乳酸含量上升。相关研究可见长吻裸颊鲷(Lethrinusminiatus)[31]、圆口铜鱼(Coreiusguichenoti)[32]、点带石斑鱼(Epinepheluscoioides)[33]及与米氏叶吻银鲛(Callorhinchusmilii)[34]等种类。空气和氨分别暴露大鳞副泥鳅72 h后和12 h内，其血浆乳酸含量显著上升(P<0.05，图3)。相似地，南美白对虾(Litopenaeusvannamei)暴露于氨氮中也会导致其血浆乳酸含量显著升高，这说明水生动物在氨应激状态下会诱导机体进行补偿性无氧代谢[35]。血浆乳酸含量的上升意味着机体缺氧或剧烈的运动。本研究中，氨暴露大鳞副泥鳅12 h后，其血浆乳酸含量显著降低，且在暴露96 h时接近对照水平(P<0.05，图3B)。同时，其血浆皮质醇含量也呈现明显的下降趋势(图1)，说明大鳞副泥鳅体内的氨耐受机制起到了很好的抗氨应激作用。众所周知，乳酸作为一种无氧代谢产物，其对机体是有害的[13]。然而，对斑马鱼(Daniorerio)的研究结果却表明，在寒冷胁迫下，乳酸的后续利用可作为维持其脑细胞生理机能的重要能量源[36]。这也为鱼类氨应激提供了另一个可选的研究方向。