低氧运动与DNA甲基化的研究进展

孟昶 朱磊 田雪文 王清路

摘 要：DNA甲基化调控基因的表达，在肥胖和2型糖尿病等代谢类疾病的发病机制中起重要作用。针对 DNA 甲基化检测研究方法包括全基因组亚硫酸盐测序（BS-seq）、甲基化 DNA 免疫共沉淀测序（Me DIP-seq）和亚硫酸氢盐测序（RRBS）。研究表明低氧与EPAS1甲基化呈负相关，与LINE-1甲基化呈正相关，低氧运动可以使CpG和DMR甲基化显著。综述DNA甲基化分子机制及相关技术，探讨低氧运动与DNA甲基化的分子机制及生理学意义，展望低氧运动与DNA甲基化的研究前景，为防治代谢类疾病提供更多依据。

关键词：低氧运动;DNA甲基化;亚硫酸氢盐测序

中图分类号：G804.7  文献标识码：A  文章编号：1009-9840（2019）05-0066-04

Abstract：DNA methylation is one of the well-known epigenetic markers that regulate gene expression and play an important role in the pathogenesis of metabolic diseases such as obesity and type 2 diabetes. Methods for DNA methylation detection include genome-wide sulfite sequencing （BS-seq）， methylated DNA immunoprecipitation sequencing （Me DIP-seq）， and bisulfite sequencing （RRBS）. Studies have shown that hypoxia is negatively correlated with EPAS1 methylation and positively correlated with LINE-1 methylation. In this paper， we review the molecular mechanism and physiological significance of hypoxia and DNA methylation by reviewing the molecular mechanisms and related technologies of DNA methylation， and prospectively study the hypoxia movement and DNA methylation research， and provide more for the prevention and treatment of metabolic diseases.

Key words：hypoxic exercise;DNA methylation;RRBS

隨着社会的进步，人民生活水平的提高，生活习惯和生活环境发生了翻天覆地的变化，伴随而来的是肥胖、三高症以及2型糖尿病等代谢类疾病发病率不断提高，并且患病人群具有年轻化趋势，严重威胁人类的健康。表观遗传学被认为是基因表达的可遗传变化，而不是由于DNA序列的任何改变[1]。表观遗传学的重要性在于对一些现象提供了部分的解释，而这些现象单靠经典遗传学是无法解释的，因此它已引起越来越多的关注[2]。DNA甲基化是最著名的表观遗传学标记之一，在基因表达修饰中起到不可忽视的作用。以往研究证实了低氧条件下对EPAS1甲基化呈负相关，与LINE-1甲基化呈正相关，而现阶段初步研究发现，低氧运动与常氧运动相比甲基化升高或降低大于25%的单个CpG甲基化位点共计675 个，所有 CpG 平均甲基化，这很可能是调控肥胖等代谢性疾病的一种重要干预手段[3-4]。本文通过综述DNA甲基化分子机制及相关技术，探讨低氧运动与DNA甲基化的分子机制及生理学意义，展望研究前景，为运动有益于健康提供更多重要依据。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是一种DNA化学修饰形式，是将甲基加入胞嘧啶或腺嘌呤的过程，还可以在不改变序列的情况下改变DNA分子活性。5-甲基胞嘧啶的甲基化在原核生物与真核生物中是广泛存在的，它是一种非常重要的表观遗传修饰，可以调控基因的活性，影响基因组印迹、细胞分化、转录调控、染色质重塑等一系列关键过程。通过基因组分析DNA甲基化对理解甲基化在正常生物学和代谢类疾病中的影响至关重要。有研究表明，哺乳动物基因组中有60%的CpG二核苷酸是甲基化的[5]。CpG二核苷酸通常存在于CpG中，通常是甲基化的基因启动子[6]。而近期在哺乳动物基因组中发现5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶、5-羧胞嘧啶等5-甲基胞嘧啶氧化衍生物，进一步拓展了人们对甲基化调控的认识[7]。

DNA甲基化是由DNA甲基转移酶引发的。DNA甲基转移酶-1（DNMT1）优先在半甲基化DNA位点进行甲基化，并且在细胞复制过程中保持甲基化模式[8]。甲基转移酶与DNA结合，从DNA螺旋中“翻转”出胞嘧啶，并将来自S-腺苷甲硫氨酸的甲基连接到胞嘧啶的5'位置[9-10]。DNMT的N-末端调节结构域包含蛋白质与DNA相互作用，蛋白质与蛋白质相互作用和核定位的基序。C末端区域含有限定酶活性位点的保守基序。DNMT3L的N-末端区域与DNMT3A和DNMT3B的N-末端区域具有相似性，但在其C-末端结构域中缺乏催化活性位点[11]。DNA甲基化的特征是在胞嘧啶嘧啶环的C5位或腺嘌呤环的N6位上添加一个甲基。虽然DNA甲基化是在DNA的结构被分解之前发现的，但对其在生物体中的多种功能的研究仍在继续[12]。后者可以归因于与DNA甲基化相关的过程的复杂性，以及DNA甲基化很难分析的事实[13]。一致地，DNA甲基化可以表示为表观遗传修饰，因为它将不包含在DNA序列本身中的相关信息传递给下一代。在人类中，甲基化仅限于胞嘧啶残基，主要存在于CpG中。这种二核苷酸在整个基因组中都没有得到充分的表达，但是在0.33 kb的片段中，这种二核苷酸的表达率却在增加，这就是所谓的CpG岛[14]。约40%的人类基因在启动子区中含有CpG岛，其甲基化通常与沉默表达有关[15]。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNMTs）建立和维持的，DNMT3A和DNMT3B介导新的甲基化，DNMT1维持已建立的DNA甲基化。DNA甲基化在人类中具有调控特定的基因[16]：1）特定基因的调控。2）基因组印记。3）X染色体失活。4）基因组防御。

2 DNA甲基化检测技术

DNA甲基化检测研究方法主要包括BS-seq、MeDIP-seq和RRBS三种技术，其中最经济有效的方法是RRBS技术。

2.1 BS-seq

BS-Seq是在单核苷酸分辨率下分析DNA胞嘧啶甲基化基因组的首选方法，被誉为是全基因组测序的“金标准”[17]。BS-Seq技术的基础是亚硫酸氢盐可将未甲基化的胞嘧啶脱胺成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶对治疗具有耐药性。通过对亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行深度测序，可以测量基因组中每个可映射胞嘧啶位置的甲基化水平[18]。BS-Seq是单核苷酸分辨率下甲基化状态分析最有效的方法。由于Sanger测序和大多数第二代测序方法不能区分甲基化和非甲基化胞嘧啶，测序前需要亚硫酸氢盐处理将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。然而，像PacBio这样的第三代测序能够根据聚合酶遇到修饰碱基时的停顿时间来检测DNA修饰，因此最终可能使BS-Seq方法过时[19]。

2.2 MeDIP-seq

MeDIP-seq技术由Weber于2005年首次提出[20]，这是基于抗体富集原理进行的全基因组的甲基化检测技术，该方法是将甲基化 DNA 免疫沉淀和高通量 DNA 测序技术相结合，即采用甲基化 DNA 免疫共沉淀技术，利用5′-甲基胞嘧啶抗体特异性富集基因组上已被甲基化的 DNA 片段，然后采用高通量测序，获得基因组DNA甲基化发生区域及甲基化水平等[21]。该方法的优点在于精确度较高，覆盖范围广，不需要较多的测序通量，并且成本较低，但只能确定一段DNA 区域的甲基化程度[22]。

2.3 RRBS

亚硫酸氢盐处理DNA可使未甲基化的胞嘧啶脱氨成尿嘧啶，不受甲基化胞嘧啶的影响[23]，从而提供了一种甲基依赖的DNA突变，这种技术被称为亚硫酸氢盐测序（RRBS）[24]。RRBS方法是在Rudolf Jaenisch的实验室中开发的，由于其成本效益和基因组中CpG位点的相对高覆蓋率而变得流行[25]。该方法特别适用于细胞数量有限的样品，如生殖细胞或卵母细胞。RRBS方法基于用MspI（5个CCGG识别位点）进行DNA消化，然后进行末端修复，接头连接，DNA亚硫酸氢盐转化和文库扩增。该方法提供了位于两个MspI位点之间的DNA片段的信息，其距离350 bp，可以代表人类基因组中大约82%的CpG岛和大约70%的启动子。近年来，以12个细胞和单个细胞为起始材料，优化了DNA甲基化组谱的还原表征RRBS方法，以研究胚胎发育过程中的甲基化组景观[26]。然而，为了从DC或SC样品中制备足够数量的下一代测序文库，进行了过量的PCR扩增（>40个循环），这可能导致大量的数据重复。由于RRBS的测序库是基于酶消化的，酶消化可以从同一位置染色体的多个拷贝中产生相同的序列，因此没有任何可用的策略可以区分这些序列是来自相同片段的不同拷贝还是来自PCR的重复诱导[27-28]。

3 低氧运动对DNA甲基化的影响

人类已适应高海拔生活的三个主要地理区域包括青藏高原、埃塞俄比亚高原和安第斯高原[29]。来自这些区域中的每个区域的人群对于低海拔人群和彼此相对地表现出独特的循环、呼吸和血液适应性。这些适应性包括动脉血氧饱和度、血红蛋白浓度、静息通气和低氧通气反应等差异[30]。然而，单靠遗传学并不能完全解释所观察到的低氧环境适应性变异程度。在高海拔地区的生长发育也被证明有助于高海拔地区的适应性特征。

表观遗传调控与遗传过程密切相关，使生物体为其生存的外部环境做好准备，并有助于提供一种潜在的机制，使其能够适应不断变化的环境条件[31-32]。DNA甲基化是理解最透彻、研究最广泛的表观遗传修饰。这种修饰最常见的发生在胞嘧啶之后是鸟嘌呤，其排列方式称为胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤（GpG）位点[33]。DNA甲基化是DNMT进行的，它选择性靶向特定的DNA序列，要么从头开始，要么维持甲基化[34-36]。内皮PAS结构域蛋白1（EPAS1）是一种缺氧激活基因，它在低氧条件下表达较高[37]，它的甲基化水平以前已经被证明与结直肠癌有关，随着甲基化的增加，EPAS1蛋白的表达降低。总之，这些发现使得EPAS1成为研究高海拔适应性表观遗传学的一个自然的先天候选。Ainash等人[17]分析了秘鲁海拔4388米和海拔0米的572名克丘亚人的EPAS1启动子区和LINE-1重复元件的DNA甲基化。在高海拔地区招募的参与者EPAS1 DNA甲基化水平较低，而LINE-1甲基化水平较高。出生的海拔与较高的1系甲基化有关，而与EPAS1甲基化无关。生活在高海拔地区的年数与EPAS1甲基化呈负相关，与LINE-1甲基化呈正相关。发现了4个单碳代谢SNP（MTHFD1 rs2236225， TYMS rs502396， FOLH1 rs202676， GLDC rs10975681），它们累积解释了平均LINE-1甲基化变异的11.29%。并确定了1号线甲基化和全基因组SNP主成分之间的关联，当前和终身暴露于高海拔缺氧环境中都会对EPAS1和LINE-1甲基化产生影响，这表明表观遗传修饰可能在高海拔适应性中发挥作用。而田雪文博士诠释了低氧运动与DNA甲基化之间的联系，通过低氧运动和常氧运动训练肥胖大鼠，从表观遗传学的角度，分析比较常氧运动肥胖大鼠和低氧运动肥胖大鼠Wnt/β-catenin信号通路 DNA甲基化的差异显著基因。初步证实了低氧运动肥胖大鼠减脂和Wnt/β-catenin 信号通路的关系。比较分析了常氧运动肥胖大鼠和低氧运动肥胖大鼠全基因组 DNA的CpG岛发生甲基化的基因，具有213 个 DMR 差异区域以及 675 个发生甲基化具有显著差异性的基因。但是，目前低氧运动与DNA甲基化的研究还处于起步阶段，其分子机制还不明确，还需进一步研究。

4 小結

DNA甲基化是著名的表观遗传学标记之一，调控基因的表达，在肥胖和2型糖尿病等代谢类疾病的发病机制中发挥重要作用。DNA 甲基化检测研究方法主要包括BS-seq、MeDIP-seq和RRBS技术，其中最经济有效的方法是RRBS技术。目前初步证实低氧运动可以使CpG和DMR甲基化显著，但是低氧运动与DNA甲基化的研究还处于起步阶段，还需要进一步研究探讨其分子机制。深入研究低氧运动与 DNA 甲基化的关系，为防治代谢类疾病提供更多依据。

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