淋巴细胞亚群在类风湿关节炎患者外周血中的表达及意义

贾淑媛,李 萍

(吉林大学中日联谊医院 风湿免疫科,吉林 长春130033)

类风湿关节炎(RA)是一种慢性的自身免疫性疾病,可累及关节滑膜、软骨,严重者出现骨破坏[1]。目前,认为其发病机制是由环境因素、遗传因素和免疫因素共同参与的,而T细胞调节紊乱是其主要的免疫机制[2]。但近年来,研究发现B细胞免疫功能失衡可能也参与了RA致病机制。已知B细胞不仅可以产生自身抗体,如类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸多肽(CCP)抗体等,形成抗原—抗体复合物沉积于关节,造成关节炎症,也可通过抗原呈递作用激活T细胞,并产生促炎因子[3]。然而,B细胞在RA外周血中的数量变化和是否对RA病情进展产生影响仍不清楚,同时B细胞是否直接参与了关节骨破坏存在一定的争议。本研究主要分析了RA外周血淋巴细胞各亚群与其疾病活动性的关系,进一步探究B细胞在RA发病和病情进展中的作用,并首次根据关节骨破坏情况对RA进行分组,探讨B细胞与RA关节骨破坏的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究收集了2018年1月-2018年10月于吉林大学中日联谊医院确诊的47名RA患者,其中男性2名,女性45名,年龄(54.3±11.0)岁,病程24(4-72)个月。所有患者均符合1987年美国风湿病学会的RA分类标准[4],排除严重的感染、血液疾病、恶性肿瘤或患有其他自身免疫性疾病者。

1.2 方法

1.2.1淋巴细胞亚群的流式检测 于清晨采取空腹静脉血2 ml,离心后放入流式管中,应用流式细胞仪测定外周血中总T淋巴细胞(CD3+)、辅助性T细胞(CD3+CD4+)、抑制性T细胞(CD3+CD8+)、B淋巴细胞(CD3-CD19+)及NK细胞(CD15+CD56+)相关表面标记物表达。

1.2.2疾病活动度指标 收集RA患者资料,包括姓名、年龄、性别、压痛关节数(TJC)、肿胀关节数(SJC)、类风湿因子(RF)、红细胞沉降率(ESR)、C-反应蛋白(CRP)、抗环瓜氨酸多肽(CCP)抗体、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、关节X线平片。根据上述资料,计算28个关节的疾病活动评分,计算公式为DAS28-CRP(3)=[0.56×sqrt(TJC28)+0.28×sqrt(SJC28)+0.36×In(CRP+1)]×1.10+1.15。按照DAS28-CRP(3)将RA患者分为2组,DAS28-CRP(3)≤5.1为低中度疾病活动组(22例),DAS28-CRP(3)>5.1为高度疾病活动组(25例)。在这47例RA患者中做过双手关节X线片的共计37人,根据RA患者双手关节X线平片,评估骨破坏情况,分为有关节骨破坏组(20例)和无关节骨破坏组(17例)。

1.3 统计学处理

所有数据采用SPSS24.0软件统计处理,正态分布计量资料以均数±标准差表示,非正态分布数据以中位数(四分位间距)表示。正态分布数据差异性采用独立样本t检验,相关性采用Pearson相关性分析,非正态分布数据差异性采用秩和检验,相关性采用Spearman相关性分析。以P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 RA患者外周血淋巴细胞各亚群与RA病情活动性的关系

根据DAS28评分将RA患者分为低中疾病活动组和高疾病活动组(见表1),采用流式细胞术分别检测两组RA患者外周血中淋巴细胞各亚群的表达情况。在高疾病活动组中外周血CD3-CD19+B淋巴细胞水平10.2%(8.5%-13.0%)明显高于低中疾病活动组(8.6%±2.3%)(P<0.05),而CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞、CD16+CD56+NK细胞表达水平及CD3+CD4+/CD3+CD8+比值在两组间的差异无统计学意义(P>0.05)。(见表2)

表1 低中疾病活动组和高疾病活动组的基本特征

2.2 CD3-CD19+B淋巴细胞水平和RA疾病活动性的相关性

上述实验已经证实高疾病活动组CD3-CD19+B淋巴细胞水平较低中疾病活动组明显升高。为进一步探究其在RA发病中的作用,本研究分析了RA患者外周血CD3-CD19+B淋巴细胞和患者疾病活动性指标的相关性,结果显示CD3-CD19+B淋巴细胞水平与DAS28-CRP(3)(r=0.304,P=0.037)、压痛关节数(r=0.298,P=0.042)、肿胀关节数(r=0.343,P=0.018)、IgA(r=0.378,P=0.010)成明显正相关,与ESR、CRP、PF、抗CCP抗体、IgG、IgM无明显相关性(P>0.05)。(见表3)

表2 RA患者外周血淋巴细胞各亚群与RA病情活动性的关系

注:“*”表示P<0.05

表3 RA患者外周血CD3-CD19+B淋巴细胞水平与RA疾病活动性指标的相关性

注:“*”表示P<0.05

2.3 CD3-CD19 B淋巴细胞水平和关节骨破坏的关系

为研究B细胞和RA关节骨破坏之间的关系,本研究将RA患者分为关节骨破坏组和无关节骨破坏组,比较了两组间外周血CD3-CD19+B淋巴细胞的水平。关节骨破坏组外周血CD3-CD19+B淋巴细胞水平为10.25%(8.50%-12.60%)明显高于无关节骨破坏组(8.97%±2.36%)(P=0.046)。(见图1)

注:“*”表示两组间比较P<0.05

3 讨论

RA的发病机制目前尚不明确,研究认为其发病可能与T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞的数量和功能紊乱有关。CD19是一个分子量为95 kDa的免疫球蛋白超家族成员,表达于除浆细胞之外的分化发育各阶段B淋巴细胞表面[5]。CD19对B淋巴细胞的生成、活化、增殖及其信号转导起重要的作用,当体内B淋巴细胞表面的CD19分子异常表达时可能导致疾病发生。动物实验表明在转基因小鼠中CD19过度表达可产生大量自身抗体,诱导自身免疫病的发生[6]。同时B淋巴细胞靶向治疗药—利妥昔单抗已在临床上得到广泛应用,它主要通过消耗B淋巴细胞来改善RA患者的临床症状,其疗效也获得了很好的肯定[7,8]。本次研究发现在RA患者外周血中CD3-CD19+B淋巴细胞数量在高疾病活动组较低中疾病活动组明显升高,且B淋巴细胞数量和DAS28成明显正相关性。这和潘惠[9]等人研究结果相似,提示B淋巴细胞可能参与RA的发病机制,抑制B淋巴细胞的产生有助于阻止RA的发生,且外周血中的B淋巴细胞可能可以作为评估RA患者疾病严重程度的指标之一。而B淋巴细胞水平和血IgA水平呈正相关,提示RA患者B细胞过度表达和免疫球蛋白产生有关。

RA骨破坏机制十分复杂,目前公认破骨细胞是导致骨破坏的重要因素[10],而核因子κB受体活化因子配体(RANKL)是破骨细胞分化的关键分子之一[11]。之前研究认为激活的T淋巴细胞表达RANKL,后者和其受体RANK结合后,诱导破骨细胞生成和活化,并抑制其凋亡,从而使破骨细胞数量增加[12],骨重吸收和骨重建调节失衡,最终导致骨破坏。近几年研究发现RANKL也表达于B淋巴细胞表面[13],提示B淋巴细胞可能也参与了骨破坏的发生。已有研究证明B淋巴细胞产生的抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)可识别破骨细胞及其前体细胞表面的瓜氨酸波形蛋白,从而增加破骨细胞的生成和分化,促进骨重吸收,介导骨破坏发生[14]。说明B淋巴细胞除了产生自身抗体介导骨破坏发生之外,也能通过非抗体依赖途径直接参与骨破坏的发生。本研究首次发现RA关节骨破坏组中外周血CD3-CD19+B淋巴细胞水平较无关节骨破坏组明显升高,提示B淋巴细胞可能参与了RA骨破坏形成。

CD3+表达于所有T细胞表面,故认为CD3+T细胞为总T细胞,按其表面抗原的表达分为辅助性T(Th)细胞和抑制性T(Tc)细胞,分别表达CD3+CD4+和CD3+CD8+。CD4+T细胞通过增加白细胞介素-6、白细胞介素-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性因子分泌,减少IL-10、INF-α等抑炎因子分泌,促进RA的发展。而CD8+T在RA致病机制中的作用并不显著。本研究发现在RA高疾病活动组和低中疾病活动组中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞水平及其比值未见明显变化。这和梅序桥[15]等人的实验结果相似,他们研究发现在不同活动性RA患者外周血中T淋巴细胞亚群水平无明显变化,但和正常人比较CD4+T细胞明显减少。

NK细胞主要参与机体固有免疫,具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等作用。研究发现在RA患者滑膜中有大量NK细胞的沉积[16]。但NK细胞在RA中的作用仍不清楚,且RA患者外周血中NK细胞的数量变化也存在争议,有些研究发现NK细胞数量正常,而有些研究提示其数量减少[16-18]。本研究发现NK细胞在高疾病活动组和低中疾病活动组中无明显变化。故NK细胞在RA中的致病机制和治疗中的潜在应用尚需进一步研究证实。

综上所述,本研究发现B淋巴细胞水平与RA疾病活动性有关,且首次证实了在RA关节骨破坏组中CD3-CD19+B淋巴细胞数量明显升高,抑制B淋巴细胞可能对治疗RA关节骨破坏提供新的思路。