髓过氧物酶(MPO)孤立表达在急性B淋巴细胞白血病患者生存结局中的临床价值

洪 俊,饶永彩

(1.武汉大学人民医院 检验科,湖北 武汉430060；2.武汉生物制品所，湖北 武汉430060)

对急性白血病患者进行正确分类是采用最佳治疗方案的关键。2008年世界卫生组织(WHO)关于造血和淋巴组织肿瘤中对急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的分类诊断是基于B淋巴细胞早期分化的免疫表型证据进行定义的[1]。然而，当伴随有显著粒细胞或T系抗原共表达时， 2008版 WHO分类直接将这种情况归为混合表型急性白血病(MPAL)。在新版的2016 WHO分类中也没有对该分类方式进行修订和更新[2]，髓过氧化物酶(MPO)的表达被认为是细胞髓系来源的确凿证据之一；通常，典型的髓系分化往往伴随着除MPO外的其他髓系分化证据。

然而，有研究表明[2-4]部分非典型B-ALL的免疫表型分析中会出现孤立表达MPO的现象(仅MPO表达无其他任何髓系标志表达)；尽管这种情况在客观上符合2008年WHO关于MPAL(B系 /髓系)的标准，但不少学者一直不建议在没有其他特征性细胞遗传学异常情况下将这些病例草率归于MPAL，建议慎重诊断[2-4]。此外，按照欧洲白血病免疫特征分类(EGIL)分类标准，孤立表达MPO 非典型 B-ALL免疫表型的髓系标志积分如果达不到诊断MPAL的评分阈值应直接归为B-ALL[5]。

另外，在2016年的WHO分类更新中，提到了非典型B-ALL存在以低水平的MPO表达是其唯一的骨髓特征的现象，并指出“这一发现的临床意义尚未确定[2]。

因此，研究孤立表达MPO的临床意义，对于这种罕见急性白血病的准确分类，从而指导临床治疗至关重要。

有不少文献报道过孤立表达MPO的B-ALL病例[6]。然而，关于这种病例与采用化疗方案后临床结局的关系研究很少。

本研究目的是通过对本院诊断类似病例的回顾性分析以研究孤立表达MPO 非典型 B-ALL患者在临床预后方面与B-ALL和MPAL(B系 /髓系)的差异,非典型B-ALL中流式MPO孤立表达阳性的频率以及流式与细胞化学和免疫组化在MPO阳性结果方面的一致性。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集于2013年 1 月- 2017年12月本院住院和门诊临床诊断为B-ALL或MPAL(B系 /髓系)的 3至35岁的儿童，青少年和成年人的骨髓、手术活检和细胞学标本。将研究对象分成3组： B-ALL组(为对照组)、MPO孤立表达的B-ALL组(即B-ALL-iso MPO)和MPAL(B系 /髓系)组。定义B-ALL时采用CD19作为筛选免疫表型标记并加上其它的B谱系免疫表型证据。为了获得均一的B-ALL群体作为对照组，本文排除了BCR-ABL易位病例(n=10)，MLL重排(n=29)，唐氏综合征(n=10)，亚二倍体(n=2)和t(5;14)2例。B-ALL-iso MPO组被定义为仅MPO单独表达(即没有其他髓系标志物共表达)且原始细胞超过20%的非典型B-ALL。如果病例除了MPO之外还表达髓样或单核细胞的标志物时则被指定为MPAL(B系 /髓系)。共有217例符合标准B-ALL标准，31例符合B-All-isoMPO标准，19例符合MPAL(B/myeloid)。收集的其他信息包括风险信息(高风险(HR)或标准风险(SR)(NCI / Rome标准)，治疗方案，诊断年龄，性别，白细胞计数诊断，荧光原位杂交数据，细胞遗传学数据，复发时间，死亡时间和CD标记的表达，以上所有取样均获得患者的知情同意书。

1.2 试剂和仪器BD Canto II流式细胞仪，美国BD公司生产。所用检测试剂为BD公司原厂配套。

1.3 方法

1.3.1流式细胞术

流式样本处理具体方法参见[7]，流式细胞仪检测包括以下荧光标记单克隆抗体组合：CD10(克隆Hi10a； BD)，CD19(克隆H1B19；BD)，CD20(克隆L27；BD)，CD22(克隆HiB22和克隆S- HCL -1；BD)，CD24(克隆ML5；BD)，CD3(克隆UCHT1；BD)，CD4(克隆SK3；BD)，CD5(克隆BL1 BD)，CD7(克隆8H81；BD)，CD8(克隆SK3；BD)，CD9(克隆ML13；BD)，CD13(克隆L138；BD)，CD14(克隆MQP9；BD)，CD15(克隆MMA；BD)，CD33(克隆p67.6；BD)，CD64(克隆10.1；BD)，末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)(Supertechs,)，MPO(克隆8E6；Life Tech,)，CD34(克隆MY10；BD)，CD117(克隆104D2；BD)，CD45(克隆2D1；BD)，CD58(克隆IC3；BD)。采用美国BD Canto II流式细胞仪对所有样本进行检测，数据分析采用FACS-Diva软件；检测前，用CST校准微球校准流式细胞仪的电压及增益。每个样品测定管至少取细胞数200,000个。

通过CD45和散射光侧向角(Side scatter，SSC)的特点将细胞分为淋巴细胞群、单核细胞群、粒细胞群、原始细胞群、前体细胞群及有核红细胞群。胞内MPO与TdT所有病例均进行表达评估。将白血病细胞中MPO的表达与相应的内部阴性、同种型和阳性对照进行比较。

1.3.2免疫组化

采用Leica自动Bond系统对MPO(克隆59A5;Leica Biosystems，Newcastle，UK)进行免疫组织化学免疫组织化学分析。如果存在于淋巴母细胞上，染色被解释为阳性。

1.3.3酶细胞化学技术

所有的骨髓片均分别进行了髓过氧化物酶(CMPO)，苏丹黑B(SBB)，非特异性酯酶(NSE)和碘酸雪夫(PAS)以及常规的詹纳-姬姆萨染色。筛选至少100个原始细胞,≥3%原始细胞的显示为CMPO阳性时即判断为髓系[8]。

1.3.4统计

3组患者根据性别和NCI/罗马风险类别进行χ2检验。根据年龄和WBC结果进行Kruskal-Wallis检验，并根据复发和死亡百分比等进行Fisher精确检验。B-ALL-isoMPO的相对频率计算为为占2013年至2017年在CHLA诊断的所有新发B-ALL和MPAL(B/髓样)患者的百分比。符合正态分布资料用均值(X)±标准差(S)表示，组间比较采用t检验。对结果数据采用生存分析评估3组患者累计复发率CIR(形态学完全缓解后首次复发的时间)，无事件生存率(EFS)(定义为复发或死亡时间)和总生存率(OS)。采用Kaplan-Meier分析对3组患者CIR、EFS、OS进行单因素比较。

对每个结果建立单独的Cox多元回归模型，以评估在患者控制临床特征之后B-ALL中MPO孤立表达的影响。P<0.05为差异有统计学意义。统计分析采用SPSS17.0软件。

2 结果

在2013年至2017年期间，共有217例符合标准B-ALL标准，31例符合B-All-isoMPO标准，19例符合MPAL(B/myeloid)。表1总结了3组髓样抗原表达情况。 B-ALL，BALL-isoMPO和MPAL患者的中位随访时间分别为44.1个月(范围0.6-90.1个月)，48.1个月(范围，7.5-81.7个月)和32.7个月(范围，0.6- 71.3个月)。以上病例没有出现MLL或BCR-ABL重排。

2.1 细胞化学、免疫组织化学和流式细胞术的MPO表达的结果缺乏一致性

在2013到2017年间所有诊断为B-ALL和MPAL的白血病病例中， B-All-isoMPO病例约占总体的 11.6%(31/267)。B-ALL、B-ALL-isoMPO和MPAL 3组的MPO流式表达水平分别为1.9%±1.5%，58.6%±20.1%，40.2%±22.0%，B-ALL-isoMPO和MPAL 组MPO表达水平显著高于B-ALL组(t=2.43、2.35，P= 0.027、0.033<0.05)。

表1 B-ALL，BALL-isoMPO和MPAL 3组髓样抗原表达阳性率

注：B-ALL，B细胞急性淋巴细胞白血病；B-ALISOMPO，B细胞急性淋巴细胞白血病，流式细胞术表达MPO；MPAL，混合表型急性白血病；MPO，髓过氧化物酶

31例B-All-isoMPO病例中有20例是在新鲜切割的组织上进行MPO免疫组织化学染色，其中，1例是在存档的染色片子上进行了回顾分析。其余病例因无充足的可用组织未做化染。在以上21个MPO染色的病例中，仅有1个(4.8%)病例显示淋巴母细胞的部分阳性染色。31例B-All-isoMPO病例中有29例进行细胞化学染色，仅1例(3.4%)阳性。细胞化学阳性病例与免疫组化(IHC)阳性的病例不是同一病例。

2.2 B-ALL-isoMPO患者MPO的流式表达模式

本文结果显示3组患者流式MPO表达模式可以分为以下2种。第1种模式是最常见的(25/31病例)如图1 C所示MPO表达呈从淋巴母细胞群延伸的拖尾状表达。10例复发患者均表现出这种MPO表达模式。第2种表达模式是淋巴母细胞群大部分呈均一阳性MPO表达，(6/31病例)如图1F所示。

2.3 CIR(累计复发率)

单因素分析结果显示B-ALL、B-ALL-iso MPO和MPAL 3组之间的CIR差异显著(log秩P=0.0071；图2)。CIR的多元Cox回归模型分析显示(表2)，B-ALL-iso MPO组在校正年龄、WBC和性别差异后复发风险仍明显增加(HR2.57、95 %CI 1.01-6.15、P=0.031)。与B-ALL组相比，MPAL组CIR有增加趋势，但未达到显著型差异水平(HR 2.70；95 %CI，0.95-7.89；P=0.80)。另外，年龄和WBC与CIR相关(P= 0.010，P<0.0001)，性别与CIR无关(P=0.910)。

图1 B-ALL-isoMPO患者呈现两种MPO的流式表达模式：尾状部分表达模式：( C)，和均匀阳性表达模式(F)，TdT，末端脱氧核苷酸转移酶。

图2 CIR Kaplan-Meier 分析图。单因素分析结果显示B-ALL-iso MPO 患者复发率显著高于B-ALL、MPAL：混合表型急性白血病(*Log-rankP=0.0071)

表2 CIR的多元Cox回归模型分析结果

注：B-ALL，B细胞急性淋巴细胞白血病；B-ALL-isoMPO,流式MPO检测阳性的B细胞急性淋巴细胞白血病；CI，置信区间；MPAL，混合表型急性白血病。

2.4 无事件生存率(EFS)

EFS在B-ALL、B-ALL-isoMPO和MPAL 3组中存在显著性差异(log-rank检验P=0.0053)。单因素分析结果显示B-ALL-iso MPO 患者EFS显著低于B-ALL (log-rank检验P=0.0053)。图3显示了3组患者复发或死亡时间的Kaplan Meier曲线。

在校正年龄、WBC和性别差异后，B-ALLisoMPO组的EFS更低，但在多元Cox回归模型(HR，2.11，95 % CI，0.89-5.10；P=0.081)中未达到显著性差异水平。在同一模型中，MPAL组与B-ALL(HR，2.91；95 % CI，1.01-8.11；P=0.029)相比，在校正年龄、WBC和性别差异后仍有较高的复发或死亡率。另外，年龄和WBC与EFS相关(P<0.0001，P<0.0001)，性别与EFS无关(P=0.688)，表3。

2.5 总生存率(OS)

B-ALL、B-ALL-isoMPO和MPAL 3组的生存率在对数秩检验上差异无显著性(P=0.7137)。图4显示了3组患者死亡时间的Kaplan Meier曲线。

在校正年龄、WBC和性别差异后，多元Cox回归模型显示B-ALL-isoMPO组与死亡没有显著的相关性(HR 0.93，95 %CI 0.20-3.76；P= 0.903)(表略)。另外，年龄和WBC与OS相关(P<0.0001，P=0.024)，性别与OS无关(P=0.897)(表略)。

图3 3组患者复发或死亡时间的Kaplan Meier曲线。单因素分析结果显示B-ALL-iso MPO 患者EFS显著低于B-ALL、MPAL：混合表型急性白血病(*log-rank检验P=0.0053)。

表3 复发和死亡的多元Cox回归模型分析结果

注：B-ALL，B细胞急性淋巴细胞白血病；B-ALL-isoMPO,流式MPO检测阳性的B细胞急性淋巴细胞白血病；CI，置信区间；MPAL，混合表型急性白血病。

图4 3组患者死亡时间的Kaplan Meier曲线。单因素分析结果显示B-ALL-iso MPO 患者的生存率在与其他组相比没有显著性差异、MPAL：混合表型急性白血病 (* log-rank检验P=0.7137)。

3 讨论

本文对B-ALL、B-ALL-isoMPO和MPAL 3组急性白血病患者的临床结局进行了评估。结果表明与B-ALL组相比，在采用相同治疗情况下，B-ALL-iso MPO组复发风险显著增加。此外，B-ALL-iso MPO组主要由年龄较大的男性(86.2%男性)组成，且不伴有B-ALL常见的核型改变。在CIR和EFS上，本文结果显示，B-ALL-iso MPO病例的累计复发率明显升高，无事件生存率明显下降，其特征更类似于MPAL。研究表明[9]复发是导致B-ALL死亡率的主要原因，因此，确认B-ALL患者 MPO表达与否对于患者制定最佳个体化治疗方案具有重要参考价值。

酶细胞化学方法检测判别MPO阳性的阈值是3%[10]， EGIL工作组流式MPO阳性阈值为10%[11]，但不少学者提出了不少其它的流式MPO阳性阈值设置范围从13%到28% 不等[12,13]。当前，流式细胞术的公认MPO阳性阈值尚未正式建立。本文根据实验室的情况设立了自身的MPO阳性阈值[14]。

本文结果表明流式MPO表达结果与免疫组化或细胞化学结果不相关。这与国外相关研究基本一致[15];其原因一方面可能与细胞化学和免疫组织化学方法学敏感性低有关，因此仅依赖于细胞化学和免疫组织化学来评估MPO的表达可能会导致假阴性；另一方面，有功能活性MPO酶的产生要在内质网中进行复杂的多步合成[16]，不同来源的抗体可能检测到的MPO阶段也不相同，本文用的单克隆抗体是检测MPO酶原形式。这也可能是导致3种方法结果不一致的原因。此外，当前关于B-ALL流式MPO表达模式的临床意义国内外相关研究很少,本文对此进行了观察,发现B-ALL-isoMPO组复发的所有9例的MPO流式表达模式均呈拖尾状表达,表明MPO流式的这种表达模式与复发可能存在一定相关性，当然还需增加病例进一步观察。

一般而言,正常人体细胞中MPO表达阳性是细胞髓系来源的标志[16]。然而，许多对MPO RNA、蛋白表达以及超微结构的研究数据证明MPO阳性表达同样可以出现在成人和儿童B-ALL中[17-19]。正因为如此，在2016版的WHO分类更新中，明确提到了非典型BALL存在以低水平的MPO表达是其唯一的骨髓特征的现象，并同时指出“这一发现的临床意义尚未确定[2]，这说明MPO确实是一些急性淋巴细胞白血病的特征。有研究[20]对高危儿童B-前体急性淋巴细胞白血病病例的基因表达进行了观察，发现有一部分是以MPO RNA高表达为特征的患者；进一步研究发现这些患者复发率高，主要以年龄较大的男性为主，且不伴MLL重排。该研究与本文分析结论非常相似，支持本文的结论。

一般而言高危B-ALL的定义是由临床(年龄、WBC计数)和实验室(MDR，特异性遗传损伤)的一系列因素组合来定义的。这些亚群白血病临床结局仍然有显著差异，因此，进一步丰富和完善亚型分类将有利于临床对疾病整体预后进行危险分层管理，以便能针对特定病人及时采取更精准的个体化治疗。

本文研究再次表明B-all中存在一部分孤立表达MPO的BALL，对其临床结局的分析表明这类病例代表着一种高风险的白血病，最好将其归为一个新的BALL亚类或分类为MPAL；因为，如果在诊断BALL时忽略MPO表达情况，直接诊断为普通 B-ALL，患者就可能存在治疗不足的风险。