LILRB1在口腔鳞癌中的表达及其与EMT的关系

卢丽杰 俞静佳 韦 瑜 吴婧怡 罗 胜 李 杏 范 玉 薛庆蕊 王天禹 任美思 孙宏晨 9306

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔颌面头颈部最常见的恶性肿瘤，居全球恶性肿瘤第六位，容易发生侵袭和向局部淋巴结转移，近年来OSCC 的5 年生存率没有明显改善，因此阐明OSCC 发生发展，侵袭转移的分子机制对未来提高患者预后至关重要[1]。

白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B（LILRB）是一类跨膜糖蛋白，为免疫抑制性受体[2]。LILRB1 是分布最广泛的LILRBs，在NK 细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞（DCs）、T 细胞亚群和B 细胞中均有表达[3，4]。研究发现LILRB 的表达可促进肿瘤的发展，如在肺癌，胃癌，乳腺癌和胰腺癌细胞中LILRB1 的表达上调[5]，可使癌细胞的运动和迁移能力显著增强，提示LILRB 可能与肿瘤细胞的侵袭和远处转移有密切关系。

上皮间充质转化（EMT）是指上皮细胞逐渐丧失上皮特性，上皮标志物E-cadherin 和β-catenin 下调，导致上皮细胞极性消失，细胞间连接减弱和特定细胞表面标志物丧失[6，7]。同时细胞获得间充质表型，即间质相关标志物 Vimentin，Fibronectin 和N-cadherin 上调，细胞的迁移运动能力增强[8]。EMT在肿瘤细胞侵袭和转移过程中起着至关重要的作用[9]。

目前，国内外尚无LILRB1 在口腔癌中表达的相关研究，本研究拟的目标是探究口腔鳞状细胞癌中LILRB1 的表达及其与EMT 的关系，为预防口腔癌的侵袭转移提供新的思路。

资料和方法

1.组织标本：收集中国医科大学附属口腔医院病理科2018～2019 年期间OSCC 患者20 例，其中10 例为高分化口腔鳞状细胞癌；10 例为低分化口腔鳞状细胞癌。同时收集10 例正常口腔黏膜和10 例异常增生黏膜标本作为正常对照，相关的组织标本均经过病理科鉴定，并经过患者知情同意及伦理委员会许可。

2.主要试剂：兔抗人LILRB1 单克隆抗体（EPR11256，1：200，Abcam）；兔抗人E-cadherin 和Vimentin 单克隆抗体 （ZA-0565，ZA-0260，北京中山金桥）；即用型免疫组化UltraSensitive TM SP 试剂盒（鼠/兔）（福州迈新生物技术开发有限公司）。

3.免疫组织化学染色：除切片和封片外，所有步骤均在Autostainer 480-Lab VisionTM自动染色机上完成。具体步骤如下：取材、固定、石蜡包埋，连续4μm 切片。烤片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，自来水冲洗10 分钟，PBS 冲洗。EDTA 溶液高温热修复20 分钟，自然冷却，PBS 清洗冲洗。3%过氧化氢室温孵育10 分钟，PBS 冲洗，血清封闭。滴加一抗LILRB1、E-cadherin 和Vimentin 常温孵育1 小时45分钟，PBS 冲洗。滴加二抗37℃恒温孵育30 分钟，PBS 洗片。DBA 显色5-10 分钟。苏木素复染，封片。晾干后显微镜下观察计数、图像采集并保存。

4.免疫组化结果判定标准：E-Cadherin 判定方法：每例切片随机选取五个视野进行拍摄。运用Image J 图像分析软件进行图像信息分析，设置平均灰度值为主要参数，其中平均灰度值＞177 为阴性，＜177 为阳性。Vimentin 和LILRB1 判定方法：由两名计数者双盲进行阅片。每张切片随机选取5 个视野，每个视野计数100 个细胞，根据染色程度和阳性细胞所占比例综合评分。Vimentin：无黄染为0 分，轻度黄染1 分，中度黄染2 分，重度黄染3 分；阳性细胞＜5%为0 分，5%～＜25%为1 分，25%～＜75%为2 分，≥75%为3 分。LILRB1：无染色为0 分，轻度黄染1 分，重度黄染2 分；阳性细胞≤20%为0分，20%～40%为1 分；40%～80%为2 分；＞80%为3分。每例综合评分为上述两个评分的乘积。0～2 分为阴性，＞2 分为阳性。

5.统计方法:采用SPSS23.0 统计学软件进行数据分析，计数资料比较采用Fisher 确切概率法，变量间相关性分析应用Spearman。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结果

1.LILRB1 与EMT 标记物在口腔鳞癌及正常上皮黏膜中的表达：在口腔鳞癌组织中，LILRB1 主要位于肿瘤细胞的胞浆中，少量位于肿瘤间质中；E-Cadherin 蛋白主要定位于细胞膜上；Vimentin 蛋白主要位于细胞浆中，见图1。LILRB1 在口腔癌组织中阳性表达率为65.00%（13/20），在正常上皮组织中阳性率为0.00%（0/20），差异有统计学意义；口腔鳞癌组织中E-Cadherin 蛋白的表达（20.00%，4/20）显著低于对照组（70%，14/20），差异具有统计学意义（P＝0.004）；Vimentin 在口腔鳞癌组织中的表达（100.00%，20/20） 显著高于对照组（50%，10/20），差异具有统计学意义（P＝0.000），见表1。

图1 免疫组化法检测LILRB1 与EMT 标记物在口腔鳞癌及正常上皮黏膜中的定位及表达（×200）

2.E-Cadherin、Vimentin、LILRB1 表达与临床病理参数的关系：E-Cadherin、Vimentin、LILRB1 的表达与口腔鳞癌患者性别、年龄、分化程度和淋巴结的表达差异无统计学显著性转移情况，见表2。

3.LILRB1 与EMT 标记物表达的相关性分析：Spearman 相关分析结果显示，在口腔癌组织中LILRB1 的表达与E-Cadherin 的表达呈负相关（r＝-0.628，P＝0.000），即随着LILRB1 表达的阳性率增高，E-cadherin 的蛋白呈降低趋势；与Vimentin 的表达呈正相关（r＝0.401，P＝0.010），即LILRB1 蛋白表达的越多，Vimentin 的阳性率越高，见表3。

表1 E-cadherin、Vimentin 和LILRB1 在口腔鳞癌及正常上皮组织中的表达比较

表2 E-Cadherin、Vimentin、LILRB1 表达与口腔鳞癌临床参数的关系

表3 LILRB-1 与EMT 标志物表达的相关性分析

讨论

近年来口腔鳞癌的发病率逐渐增高，经过手术及放化疗后其5 年生存率可达60%。但是口腔鳞癌容易复发及向淋巴结转移，晚期发现的癌症患者生存率只有30%左右[10]。目前，影响OSCC 转移的因素和机制尚不明确。EMT 是指在生理或病理条件下上皮细胞逐渐向间质细胞转化的过程，其在肿瘤的浸润转移中发挥着重要作用。在此过程中，肿瘤细胞极性丧失，细胞间彼此连接疏松，细胞运动侵袭能力增强，上皮标志物表达下调，间质标志物表达上调，使细胞获得间质表型，容易向远处转移[11]。E-cadherin 和Vimentin 是EMT 相关的重要标志物，本研究检测了40 例组织标本中E-cadherin 和Vimentin 的表达。OSCC 中E-cadherin 的表达较对照组下调；间质标志物Vimentin 的表达较对照组上调，表明部分肿瘤细胞发生EMT。这与Jingping Zhou 和Soussan Irani 等人的研究报道吻合[12，13]。

LILRB1 属于免疫抑制性受体，主要在NK 细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞以及淋巴细胞等细胞中表达，可以通过多种方式抑制免疫反应，从而使肿瘤细胞逃避免疫监视[14]。同时有研究发现某些肿瘤细胞中也可表达LILRB1[15～17]。Pei Zhang 等人发现LILRB1 在非小细胞肺癌中的表达增加[18]；另外胃癌组织和乳腺癌组织中也有不同程度的LILRB1 表达[17]，且异常高表达的LILRB1 与癌细胞的迁移运动密切相关，可促进癌细胞侵袭转移[19]。本研究发现OSCC 中LILRB1 的表达明显高于对照组，并且主要分布在肿瘤实质细胞，在间质微环境内仅有少量表达。

LILRB1 与EMT 的关系目前尚未有人报道，本研究发现，LILRB1 表达的增加与E-cadherin、Vimentin 表达的改变存在相关性，即LILRB1 与E-cadherin 的表达呈负相关，与Vimentin 的表达改变呈正相关，提示LILRB1 可能参与EMT 的发生。这也提示LILRB1 也许可以作为新的靶点，为以后的肿瘤治疗提供理论基础。LILRB1 影响口腔癌EMT 发生的机制尚不清楚，需要进一步研究。