改良型PRF与普通型PRF在脂肪移植应用中的实验对比研究

柳芳 赵宇 马莉

[摘要]目的：探索改良型富血小板纤维蛋白（advance platetel-rich fribin，A-PRF）与普通型富血小板纤维蛋白（platetel-rich fribin，PRF）在脂肪移植中的应用效果，进而为临床应用提供指导。方法：将18只实验兔随机分成三组，实验组（A-PRF组）：取兔背部脂肪组织，将2ml A-PRF+1ml颗粒脂肪移植到兔耳分离好的区域;阳性对照组（PRF组）：兔耳移植区移入2ml PRF+1ml颗粒脂肪;阴性对照组（NS组）：兔耳移植区移入2ml生理盐水+1ml颗粒脂肪。分别于4周、8周、12周取材进行大体观察、称重、HE染色与免疫染色来比较三组间脂肪成活差异。结果：各时间点，A-PRF组的脂肪存活率及新生毛细血管密度明显优于其他两组，PRF组结果优于NS组，且三组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：A-PRF在增加脂肪细胞成活率、减轻炎症反应及促进毛细血管新生方面优于普通型PRF，这为A-PRF的临床使用提供参考。

[关键词]A-PRF;PRF;颗粒脂肪移植;脂肪细胞成活率;VEGF;细胞因子

[中图分类号]R622    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）11-0082-04

Abstract： Objective  To explore the application of advanced platelet-rich fibrin （A-PRF） and common platelet-rich fibrin （PRF） in fat transplantation in rabbit. Provide guidance for clinical applications. Methods  Eighteen experimental rabbits were divided into three groups randdomly. The experimental group（A-PRF group）： adipose tissue was taken， and 2ml A-PRF+1ml granule fat was transplanted into the isolated area of rabbit ears. The positive control group（PRF group）： 2ml PRF+1ml granule fat was transferred into the transplantation area. The negative control group（NS group）： 2ml physiological saline +1ml granular fat was transplanted. Gross observation， weighing， HE staining and immunostaining were performed at 4 weeks， 8 weeks， and 12 weeks to compare the survival of fat between the three groups. Results  At each observation time， the fat survival rate and neonatal capillary density of the A-PRF group were significantly better than the other two groups. The positive control group was superior to the negative control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion  A-PRF is superior to common PRF in increasing the survival rate of adipocytes， reducing inflammation and promoting capillary angiogenesis， which provides a reference for the use of A-PRF in clinic.

Key words： A-PRF; PRF; granular fat transplantation; adipocyte survival rate; VEGF; cytokines

自體颗粒脂肪移植是整形学科常规项目，常用于软组织缺损修复，原因如下：①自身脂肪移植避免了移植后的免疫排斥，组织相容性好;②脂肪来源广泛，供区提供脂肪的同时可局部塑形;③移植后的脂肪细胞可部分存活，有效地保持了受区的体积。然而脂肪移植后伴随而来的坏死、液化、钙化、囊肿形成等限制了其临床应用。临床上通过各种方法来提升移植脂肪的存活率，如脂肪干细胞与基质血管成分（stromal vascular fraction，SVF）联合脂肪细胞移植、各种生长因子及后来的富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）[1]与富血小板纤维蛋白（platetel-rich fribin，PRF）[2]、抗氧化剂添加、促进血管生成药物使用、获取过程减少脂肪细胞的损伤、注射方法的改进等。其中PRF是生长因子辅助脂肪细胞移植思路的延续，PRF是血液离心时引发内源性凝血途径产生的富血小板纤维蛋白，其内富含血小板、细胞因子和炎症细胞[3-4]，PRF明显提升脂肪存活率。改良型富血小板纤维蛋白（advance platetel-rich fribin，A-PRF）是低速长时间离心得到的，已有基础研究提示A-PRF在机械韧度[5]及细胞因子释放各种方面的优越性[6]。本实验观察A-PRF、PRF在脂肪移植保存率方面是否有差别，为临床工作提供思路。

1  材料和方法

1.1 研究对象：18只健康新西兰大白兔，雌雄随机，体重（3.7±0.2）kg，饲养于安徽医科大学动物房内，饲养条件符合实验动物要求，实验征得实验伦理委员会同意。

1.2 实验主要仪器：实验台，无菌实验包，骨膜剥离子，注射器，10%水合氯醛，剃毛机，离心机，冰箱。

1.3 实验方法

1.3.1 PRF与A-PRF制备：麻醉前，采集兔耳中动脉血10ml于无抗凝剂的干管内，3 000r/min离心10min制备普通型PRF，2 000r/min离心24min制备A-PRF，均置于零下4℃冰箱内冷藏30min备用。

1.3.2 脂肪获取：麻醉后剃除兔颈背部兔毛，面积约7cm×5cm，俯卧位固定于手术台。以兔耳中动脉和耳缘静脉交界处为a点，耳缘静脉末端为b点，取ab中点为圆点，1.5cm为半径画圆，标记双耳待剥离区域。常规消毒铺巾，取颈背部正中切口，分离出约5ml脂肪，去除筋膜，剪至1mm3均匀颗粒待用。

1.3.3 分组：将18只新西兰兔随机分成3组，阳性对照组（PRF组）：1ml颗粒脂肪+2ml PRF凝胶;阴性对照组（NS组）：1ml颗粒脂肪+2ml生理盐水;实验组（A-PRF组）：1ml颗粒脂肪+2ml A-PRF凝胶。

1.3.4 脂肪移植：小型骨膜剝离子沿标记区域在皮肤与软骨层间剥离，镊子取出干管内PRF与A-PRF凝胶，小心减去下方的红色血凝块，注意保留富血小板纤维蛋白凝胶连接处的红细胞层。在未去除凝胶内水分的情况下（有研究表明细胞因子主要来自于纤维蛋白渗出产物[7]），剪至1mm3均匀颗粒，按照分组将富血小板纤维蛋白与脂肪均匀混合，移植到兔耳剥离区域内，缝合线结扎关闭切口（见图1～3），术后每只实验兔以庆大霉素80万单位连续肌注3d。

1.4 观察指标：①大体观察;②标本重量;③HE染色观察脂肪细胞成活情况;④免疫组化观察脂肪内新生毛细血管密度。

1.5 统计学分析：运用SPSS 20.0统计软件进行处理。计量资料采用均数±标准差（x?±s）表示，检验方差齐性后，多组均数间的两两比较用SNK-q检验，P<0.05差异有统计学意义。

2  结果

2.1 大体观察：根据大体观察及称重结果可见：第4周可见A-PRF组重量大于PRF组，NS组脂肪最小;第8周时三组脂肪重量均较第4周有明显增加，A-PRF组脂肪重量增长最大;12周时脂肪重量较8周有所回落，但仍旧稍高于4周，A-PRF组回落最缓。见表1，图4～5。

2.2 组织学观察：4周同样显微倍数下一个视野内A-PRF组脂肪细胞较其他两组多，且A-PRF组脂肪从大小及排列分布更均匀，相比于其他两组有更多的炎症细胞浸润。同样，PRF组脂肪切片染色优于NS组。8～12周时A-PRF组与PRF组间上述差距减少，但A-PRF组仍旧有较高密度的炎症细胞浸润在脂肪细胞周围，NS组脂肪细胞大小分布不均，且脂肪细胞数量少，三组间有明显的纤维生成。见图6。

2.3 免疫组化结果：4周时A-PRF组脂肪间免疫染色明显多于PRF组，A-PRF组可见明显新生血管形成;8～12周时两者间未见明显区别，但加入A-PRF组的脂肪细胞形态明显好于另外两组。见图7。

3  讨论

PRF是血液在离心力作用下促发内源性凝血机制得到的类似于天然纤维蛋白的凝胶状物质，相较于由加入抗凝剂制备而来的PRP相比较，PRF制作工艺简单，且无需考虑抗凝剂的安全性。PRF具有强大的促增殖能力，尤其是在骨诱导方面，由口腔科引入的PRF在促进脂肪成活方面不如骨诱导效果显著。A-PRF是2013年新提出的概念，是由更低转速更长时间离心出的血制品。A-PRF结构疏松，细胞及相应因子分布不同于普通性PRF，中性粒细胞在A-PRF中分布广泛。已有相应的基础实验研究PRF与A-PRF两者间的生物特性上的区别，但有关两者的动物实验方面的应用很少，本实验主要研究两者对于脂肪移植中细胞成活率的区别。

3.1 脂肪移植：正常脂肪可耐受缺氧极限为24h，而脂肪来源的干细胞耐缺氧的时间可长达72h，脂肪干细胞在脂肪移植后的组织重塑中起关键作用[8]。移植后的脂肪细胞除移植区域周边的细胞可通过局部渗透来获取营养存活，移植中间区域的细胞则需要新生的毛细血管生成提供营养，而正常新生血管形成需约1周时间。关于脂肪移植后体积的减少有关专家认为与移植中脂肪细胞的受损、炎症聚集导致的细胞凋亡与死亡和移植后脂肪细胞去分化的非坏死性死亡有关[9]。移植区域的体积维持原因包括宿主取代与细胞存活两种因素，宿主取代理论认为移植后脂肪细胞坏死继而引起宿主巨噬细胞的吞噬，吞噬了脂滴的巨噬细胞转化形成成熟脂肪细胞;细胞存活理论则认为移植后脂肪细胞或干细胞的存活维持了移植后的受区体积[9]。脂肪细胞在移植后去分化形成不含脂滴的成纤维细胞，该细胞称为去分化脂肪细胞，去分化脂肪细胞可更好的耐受缺氧，后可再分化为脂肪细胞[9]。无论是有关脂肪去分化的重塑还是脂肪干细胞的成活都在脂肪移植中占有重要地位。

3.2 PRF：PRF首先应用于口腔科，其在骨组织再生方面应用广泛[10]。PRF结构接近天然纤维蛋白，包含有细胞因子、血小板、纤维蛋白相关聚糖链、循环糖蛋白和纤维蛋白原。PRF中存在双侧连接和等边连接，使其具有刚性结构和可移动性，为脂肪细胞增殖迁移做指引。PRF凝块可缓慢释放出IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子和IL-4等抗炎因子，还包括血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），其是已知最强大促进血管生长因子[11]。这些细胞因子可有效地减少移植后脂肪存活区域内的炎症反应，同时诱导巨噬细胞等炎症细胞向移植区域迁移，稳定区域内环境，VEGF可有效地促进中心区的新生毛细血管生长，为缺氧的脂肪细胞提供营养。相较于释放时间短暂的PRP，PRF释放时间从5～10min开始，持续60～300min，保证了移植区内长久有效的细胞因子浓度。血液离心后得到产物HE染色由上至下：HE染色：淡黄色清亮的贫细胞层、黄色的凝胶层、红细胞层。PRF凝胶层电镜下结构为上部的纤维蛋白，中间的白细胞与下部的红细胞层[11-12]。而A-PRF在电镜观察下发现结构上更疏松且纤维蛋白结构空间更大，细胞因子分布更加均匀，包含更高浓度的中性粒细胞。而PRF的促进软硬组织生长机制似乎正与这种纤维蛋白结构相关，同样条件培养PRF与A-PRF使其缓慢释放细胞因子[3]，ELISA分析发现A-PRF无论是释放时间抑或是释放高峰浓度上都占明显优势[6]。

A-PRF在辅助兔脂肪细胞移植方面优于PRF，可进一步在基础实验及临床上观察两者辅助脂肪细胞移植修复软组织缺损方面的区别。本实验仍有需要改进的方面：①不同年龄与性别的新西兰实验兔止凝血功能不同，血小板数量功能不同，导致采取的离心血液中细胞因子和炎症细胞纤维蛋白量不同;②PRF凝胶离心后体积较难控制完全一致，具有实验误差;③不同观察时间的移植物中中性粒细胞指标未观察。

综上所述，富血小板纤维蛋白可促进实验兔移植脂肪的存活率，且A-PRF促进脂肪细胞成活作用更明显，推测其可能与A-PRF三维空间结构、细胞因子浓度及中性粒细胞比例有关。本实验有一定的临床指导意义，有关于A-PRF与颗粒脂肪的比例以及是否A-PRF在脂肪加工产物如纳米脂肪应用效果如何，有待进一步实验研究和探讨。

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[收稿日期]2019-04-29

本文引用格式：柳芳，赵宇，马莉，等.改良型PRF与普通型PRF在脂肪移植应用中的实验对比研究[J].中国美容医学，2019，28（11）：82-85.