枯否细胞在肝衰竭中的作用及机制研究进展

田光敏+刘鹏

摘要：免疫介导的损伤在肝衰竭发病机制中起十分重要的作用，与肝衰竭过程中的肝细胞坏死和疾病临床预后密切相关。枯否细胞（Kupffer，KC）是免疫系统中最著名的角色之一，定植于肝脏血窦内皮之间，具有高度活性，它可以吞噬和清除从肠道来的微生物，又可被细菌脂多糖或细胞超抗原激活，释放炎症介质进入血液中，激活众多的炎性细胞，参与肝脏的炎症反应。本文就KC在肝衰竭中的作用机制的研究进展作一综述。

关键词：KC；肝衰竭；细胞因子；调节机制

肝衰竭是多种因素引起的严重而广泛的肝细胞死亡，导致肝脏本身合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血机制障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床证候群。肝衰竭内科综合治疗效果不佳，预后差，病死率高，严重威胁患者的生命健康，影响社会稳定。肝衰竭的发病机制复杂，已成为肝病学的研究热点。最近研究表明肝衰竭的发病机制大体可归为两类：直接损伤和免疫介导的损伤，而免疫学机制特别是以免疫细胞动员和细胞因子的大量分泌为代表的免疫系统活化是急性肝衰竭发病的中心环节。KC是定居于肝血窦内的巨噬细胞，胃肠道来源的毒素、微生物以及机体衰老的红细胞等，经门静脉到达肝脏后，首先要经过 KC这道防线。KC过度活化，并分泌多种细胞因子在肝衰竭发病机制中起重要的作用，若能深入研究肝衰竭进程中KC的作用机制，早期抑制KC的过度活化，阻止炎症重症化，便有可能从源头上遏制肝衰竭的发生。

1 KC的一般特性及功能

KC是肝脏驻留性巨噬细胞，在健康肝脏中，KC占机体全部组织特性巨噬细胞的80～90%、肝脏所有细胞的15 %以及肝脏非实质细胞的35%。KC主要定居在肝血窦中，有43%位于门静脉区，29%位于中央静脉区，剩余的28%则位于肝小叶的中部区域，这种分布可以让其第一时间高效地吞噬来源于门脉循环的病原体。其生物功能具有两面性，一方面能清除细菌及毒素发挥抗感染作用；另一方面通过释放各种炎症介质放大炎症反应而造成组织损伤。此外，KC还可影响肝细胞、星状细胞、内皮细胞等肝内主要组成细胞的生物学功能。

2 KC在肝衰竭中的作用及机制

2.1 KC在肝衰竭过程中表型 巨噬細胞有很强的可塑性，目前最主流的分型方法是将巨噬细胞分为：经典传统活化的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞，这些表型的极化是受细胞所处的微环境所影响。活化的M1巨噬细胞与I型细胞因子（如TNF-α、IL-6 和INF-γ）有关，表现出强大的促炎效应，可以促进Th1免疫应答。与之相反，活化的M2型巨噬细胞释放一些免疫调节介质（如IL-4、IL-10和IL-13），抑制炎症和促进组织修复，促进Th2型方向的免疫效应。KC是位于肝内的巨噬细胞，是组织中数量最多的一种巨噬细胞。 正常状态下，不成熟的KC多分化为M2型，以维持肝脏内的免疫耐受。在ALF的早期，活化的KC表现出M1表型，释放大量的炎性介质，如IFN-γ、TNF-α 、HMGB1、fgl2等，促进肝损伤。在ALF的缓解期，KC更多表现出M2型的特点，产生抗炎因子和促增殖细胞因子，如IL-10、IL-6、CDl63等，调节过度的免疫反应，促进组织修复[2]。

2.2 KC与细胞因子

2.2.1早期的M1型KCs细胞分泌促炎因子，介导肝毒性作用 在ALF早期，KC受到各种转化信号通路的活化，成为经典活化的M1表型，释放大量的前炎症介质，如TNF-a、IFN-γ、ROS、HMGB-1、fgl2等，促进肝损伤。

2.2.1.1肿瘤坏死因子-α 在KC释放的众多炎症介质当中，TNF-α是最受瞩目的。它在炎症、细胞凋亡以及促进KC向"M1"型化过程中均起重要作用。KC 分泌的TNF-α是肝内该细胞因子的主要来源，低浓度的 TNF-α能够刺激肝细胞再生，而高浓度的 TNF-α则导致肝细胞坏死。肝脏炎症时，刺激 KC 分泌大量的 TNF-α加重肝脏的炎症，进一步导致肝细胞坏死。有研究发现，KC受内毒素刺激后大量分泌TNF-α，其数量与肝细胞凋亡程度成正相关，用TNF-α单抗阻断后肝细胞凋亡数目明显下降。在LPS/GalN和Con A介导的小鼠急性肝衰竭模型中，血清和肝组织中的TNF-α水平均升高，用中和性TNF抗体预处理小鼠，或对TNF-α进行基因敲除，均对肝损伤有保护作用[3]。

2.2.1.2 IFN- γ 具有抗病毒和促炎症效应双重效应。许多研究发现，在病毒相关性或化学损伤相关性的ALF时，IFN-γ的表达增加，在体内给予抗IFN-γ中和性抗体，可以通过抑制IFN-γ和TNF-a的分泌而减轻肝损伤[4]，且过量并持续的 IFN-γ表达能刺激KC产生极强的细胞毒性。

2.2.1.3 HMGB1 HMGB1具有刺激其他炎症细胞因子释放的功能，参与了肝衰竭的发生发展，对肝衰竭的诊断和治疗有重要的意义。临床研究表明，在肝衰竭的过程中，活化的KC细胞可以主动释放 HMGB1，HMGB1 通过晚期糖化终产物受体和 Toll 样受体4等发挥促炎症因子的作用。阳乔等[5]通过体外实验，得出肝脏KC细胞中HMGB1的表达在肝衰竭早期明显增高。赵中夫等[6]在LPS诱导原代培养肝实质细胞与KC细胞表达和释放HMGB1的实验中，得出经LPS诱导6 h，肝实质细胞和枯否细胞培养液中 HMGB1含量无显著差异；但在继续诱导12～48 h后 ，KC培养液中HMBG 1显著增加，且明显高于相应时间点的肝实质细胞培养液HMGB1含量，从而得出KC细胞是肝衰竭发生发展过程中促炎因子HMGB1的主要来源细胞。

2.2.1.4凝血酶原酶蛋白-2（fibrinogen-like protein2，fgl 2） 凝血酶原酶是新近发现的一种新的免疫凝血因子，正常情况下，fgl2 在内皮细胞、CTL等中微量表达，在病毒感染或细胞因子如IFN γ 诱导下，单核细胞等可高表达。研究发现，小鼠感染小鼠肝炎病毒（MHV-3）后，由巨噬细胞和内皮细胞分泌的 fgl2 在肝脏选择性高表达，fgl2可通过直接裂解凝血酶原转化为凝血酶而启动免疫凝血过程，促使局部微小血栓的形成和肝细胞缺血缺氧性坏死进而加重肝损伤。用中和性fgl2抗体或fgl2.siRHA质粒进行体内研究，结果显示肝脏中纤维胶原沉积减少，小鼠生存率明显提高，提示fgl2可能是治疗人类病毒相关性肝衰竭的靶分子。

2.2.1.5氧自由基 氧自由基作为一种含一个未配对的化学物质，几乎可以损伤体内所有的活性物质，包括蛋白质，核酸及某些大分子物质。 KC 被激活后能够产生大量的氧自由基，通过使细胞膜脂质过氧化，产生其它促炎症介质，导致细胞氧化应激以及组织病理性损伤。氧自由基不但能够直接损伤肝细胞， 还能引起内皮细胞和库否细胞肿胀， 从而导致肝脏微循环障碍，加重肝脏损伤。早期研究提示，活化的肝脏巨噬细胞可释放超氧离子，介导如LPS、ConA和缺血缺氧性肝损伤过程，用自由基清除剂可以减轻肝脏炎症反应。

2.2.1.6趋化因子 趋化因子可引导免疫细胞迁移，研究已证明由趋化因子-趋化因子受体相互作用诱导免疫细胞浸润是许多急性和慢性肝病的致病因素。单核趋化蛋白-1（MCP-1），也称CCL2，是一种经典的单核/巨噬细胞趋化因子，它可作用于细胞的CCR2，在许多炎症反应中动员和募集细胞。国内外研究证明，发生肝衰竭时，作为CC类趋化因子MCP-1作用于于KC的受体CCR2，动员骨髓中的活化的单核巨噬细胞并使其游走向肝脏，参与急性肝衰竭的进展。

2.2.2 M2型KC分泌抗炎因子，起肝脏保护作用 在ALF的整个过程中，部分自我更新的KC呈现 M2型细胞样作用，分泌IL-10、IL-6、CDl63等抗炎及促增殖的细胞因子，发挥免疫调节及促进肝脏损伤修复的功能，特别是在的后期阶段M2细胞样作用的KC起主导作用。阐明这类KC细胞表型及增殖的调节机制，有助于为ALF的免疫治疗提供新的思路。

2.2.2.1 IL-10 肝脏中的IL-10主要是由M2型KC和调节性T细胞（Tregs）产生的，其主要作用是拮抗促炎症效应，诱导免疫耐受。在LPS/GalN介导的肝衰竭时，体内TNF-γ和IL-10水平平行上升，提示促炎症M1型KC和抑炎症M2型KC之间存在着相互作用的关系[7]。

2.2.2.2 IL-6 主要由T细胞和巨噬细胞产生，是一种多功能炎症因子，参与调节T细胞活化、分化和肝细胞的再生过程。在急性肝衰竭动物模型中，血清中的 IL-6水平显著升高，肝脏浸润细胞可表达正常10倍以上的 IL -6。IL-6 可以通过促进肝细胞再生、诱导热休克蛋白表达，抑制NKT细胞活性对肝脏产生保护作用，或通过激活抗凋亡途径如诱导肝细胞表达 Bcl-x1抑制肝细胞凋亡。也有研究发现，IL-6和转化生长因子（ TGF -β）能通过激活转录因子维甲酸相关孤独受体（ROR） γt和RORα 促进 Th17 细胞的分化，IL -6 还可通过诱导STAT3的表达上调 Th17细胞导致慢加急性肝衰竭[8]。

2.2.2.3 CD163 CD163 是清道夫受体家族成员之一，特异性地表达在单核/巨噬细胞群中，是单核细胞分化成巨噬细胞的标志，大量CD163分子的表达被认为是巨噬细胞活化的标志活化。KC可以释放可溶性CD163参与机体抑炎症效应。

2.3 KC与邻近细胞在肝衰竭中的相互作用 KC作为肝脏中重要的天然免疫细胞之一，它调控着肝脏的早期炎症反应，它与其它临近细胞之间相互作用，很大程度上决定着肝炎发生的结局。KC常受肠道细菌、微生物碎片和LPS等因子刺激， 释放细胞因子、类前列腺素、氧化亚氮和活性氧簇； 这些因子一方面调控KC自身的功能活性， 介导炎症反应， 另一方面又和邻近细胞（肝细胞、星形細胞、内皮细胞以及其他旁路免疫细胞）产生交互调控。尽管这是一个复杂的网络系统，随着肝脏各细胞成分分离技术的成熟和体外共培养系统的建立，各细胞类型之间的相互作用成为研究的热点。

2.3.1 KC与肝窦内皮细胞之间的作用 在肝窦Dissc间隙中，肝窦内皮细胞（LSECs）与KC毗邻。肝脏巨噬细胞活化后释放的TNF-a，超氧阴离子可以直接损伤LSECs，而且KC释放的fgl2可诱导纤维蛋白沉积和微小血栓形成，造成邻近LSECs缺血缺氧性损伤[9]。LSECs和KC间还可能通过胞内粘附分子-1（ICAM-1）/白细胞功能相关抗原-1（LFA-1）相互作用。该粘附分子的单克隆抗体对肝孢子虫感染相关的肝损伤有保护作用。

2.3.2 KC与中性粒细胞之间的作用 KC和中性粒细胞均是肝脏中关键的天然免疫防御成分，KC吞噬损伤细胞后，通过LFA-1和CD54与中性粒细胞相互作用，激活中性粒细胞，后者再把细菌杀死，有效地抵御细菌感染[10]。在内毒素相关的或缺血再灌注相关的肝损伤中，由KC释放的TNF-a和细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子（CrNC）可以介导中性粒细胞向肝窦间隙浸润。同时，KC还可以吞噬并消化衰老/凋亡的中性粒细胞，维持肝脏免疫稳态[11]。

2.3.3 KC与NK细胞之间的作用 日本科学家发现，KC通过产生前列腺素可抑制NK细胞的细胞毒作用，而通过分泌I/II干扰素、IL-12和IL-18则可增强NK细胞的活力和细胞毒性，两类细胞间的相互作用还可通过NKG2D-Rael、TLR信号和细胞接触而实现。由于巨噬细胞-NK细胞效应是肝脏的第一道免疫防线，进一步深入研究这两类细胞之间窜话的分子机制是很有必要的。

2.4 KC可通过Fas/FasL途径对肝脏造成损失 Fas是细胞表面重要的死亡受体，是细胞凋亡的信号分子。Fas与其配体FasL结合，活化并传导凋亡信号，是诱导细胞凋亡的重要途径。有研究表明，当肝脏发生衰竭时，KC被激活后，表达大量的FasL，同时受损伤的肝细胞表达大量的Fas，Fas与FasL结合可触发肝细胞的凋亡。Gallagher等[12]的研究显示，从造模成功的肝衰竭大鼠肝脏中提取的KC高表达FasL mRNA，而且Fas也同时上调，从而介导受损的肝细胞发生凋亡，肝细胞大量坏死，进而发生肝衰竭。朱人敏等[13]人通过对KC表达的Fas配体在急性胰腺炎并发肝损伤中的作用的研究结果表明急性胰腺炎通过上调 KC FasL的生成介导了肝损伤， KC抑制剂GdCl，能通过抑制FasL的表达发挥保护肝脏的作用。Mita等[14]对24名接受肝移植的暴发型肝衰竭（FHF）患者进行了检测，发现FasL主要表达在肝脏巨噬细胞，通过Fas/FasL 途径激活肝细胞的凋亡通路，从而造成严重的肝损伤。

3展望

KC特殊的解剖结构和生理功能， 以及他在肝脏和全身巨噬细胞中所处的地位和性质， 决定了他在肝脏乃至全身天然免疫和获得性免疫反应中具有的重要作用，是内毒素性肝损害和多种肝脏疾病发生发展的关键因素。因此，进一步深入研究 KC的功能及其调控的分子机制显得尤为重要。我们认为在今后的研究工作中，深入揭示KC介导的免疫功能，及其对肝衰竭的调控机制，以及与邻近细胞的相互作用可能对临床的研究和治疗具有指导意义。

参考文献：

[1]Bilzer M，Roggel F，Gerbes AL.Role of Kupffer cells in host defense and liver disease[J].Liver Int，2006，26：1175，1186.

[2]李静，孙剑勇.肝衰竭免疫学发病机制研究进展[J].Chinese Hepatology，2013，18（6）：417-418.

[3]Micheau O，Tschopp J.Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes[J].Cell，2003，114：181-190.

[4]Fan xP，Zou ZQ，Long B，et al.Enhanced demethylation of interferon-γ gene promoter in peripheral blood mononuclear cells is associated With acute-on-chronic hepatitis B liver failure[J].Tohoku J Exp Med，2011，224：13-19.

[5]阳乔.单核/巨噬细胞在肝衰竭中的作用及调节机制研究[D].浙江：浙江大学，2013.

[6]赵中夫，韩德五，刘明社，等.LPS诱导原代培养肝实质细胞与枯否细胞表达和释放HMGB1[J].现代消化及介人诊疗，2007，12：99-103.

[7]Li J，Wu W，Peng G Chen F，et al.HBcAg induces interleukin-1 0 production，inhibiting HBcAg-specific Thl 7 responses in chronic hepatitis B patients[J].Immunol Cell Bi，2010，88：834-841.

[8]陈智，朱海红，杨英.细胞因子风暴与肝衰竭[J]. 临床肝胆病杂志，2014，30（10）：981-983.

[9]Gao S，Wang M，Ye H，et al.Dual interference with novel genes mfgl2 and mTNFRl ameliorates murine hepatitis virus type 3-induced fulminant hepatitis in BALB/cJ mice[J].Hum Gene Ther，2010，21：969-977.

[10]Holub M，Cheng cw，Mott S，et al.Neutrophils sequestered in the liver suppress the proinflammatory response of Kupffer cells to systemic bacterial infection[J].J Immun01，2009，183：3309-3316.

[11]Shi J，Fujieda H，Kokubo Y Wake K.Apoptosis of neutrophils and their elimination by Kupffer cells in rat liver[J].Hepatology，1996，24：1256-1263.

[12]Gallagher SF，Yang J，Basksh K，et al.Acute pancreatitis induces FasL gene.expression and apoptosis in the liver[J].J Surg Res，2004，122（2）：201.

[13]朱人敏，袁柏思，张晓华，等.Kupffer细胞表达的Fas配体在急性胰腺炎并发肝损伤中的作用[J].解放军医学杂志，2008，33（10）：1180-1182.

[14]Mita A，Hashikura Y，Tagawa Y，el al.Expression of Fas ligand by hepatic macrophages in patients with fulmmant hepatic failure[J].Am J Gastroentenol，2005，100：2551-2559.

編辑/申磊