一株红酵母产类胡萝卜素的定性及定量分析

郁桂聪 孙新军 穆长青 赵凤娟

摘要：指出了类胡萝卜素是一类重要的天然色素，在食品与医学上具有很高的应用价值。红酵母是其重要的微生物菌种来源，因其生产要求简单、发酵周期短且发酵工艺易于调控，具有较好的规模化培养潜力而备受关注。实验优选了1株红酵母，提取其油脂，并运用HPLC法对其类胡萝卜素进行了分离、鉴定及定量分析。结果成功分离鉴定出4种胡萝卜素，即β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、红酵母红素和圆酵母素，并测得了其在每克油脂中的含量分别为：48ug、60ug、206ug、544ug，在每克干茵体中的含量分别为23ug、29ug、98ug、259ug，实现了对红酵母类胡萝卜素的定性及定量分析。实验结果可为红酵母提取类胡萝卜素工艺参数的优化与优良产油红酵母种质资源的筛选提供依据。

关键词：红酵母;类胡萝卜素;高效液相色谱法（HPLC）

中图分类号：TS261.1 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）18-0171-03

1引言

类胡萝卜素（carotenoid）一般为C40的萜结构的较为多见，在空气中不稳定，容易被氧化，但类胡萝卜素可以作为食品添加剂和营养品，同时在医学方面也具有很大价值，例如：预防血管硬化、抑制肿瘤发生、增加宿主免疫力和抗氧化等功能等，因而备受关注。红酵母作为生产类胡萝卜素的主要菌种来源，其发酵周期短和营养需求较低，生产过程易于调控，培养技术已经较为成熟，所以应用红酵母生产类胡萝卜素具有很高的应用价值和较好的开发前景。

类胡萝卜素是一种发酵胞内色素，而酵母细胞壁厚不易破损，所以使得红酵母提取类胡萝卜素具有一定困难。在酵母细胞壁破碎众多方法中，酸热法是最为常见破碎细胞壁的方法。HPLC法是高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography）的简称，是色谱法的一个重要分支，它是利用液体作为流动相，将具有不同极性溶剂、缓冲液等流动相泵入到装有固定相的色谱柱。利用色谱柱与不同类胡萝卜素的结合能力不同，使得各种类胡萝卜素通过色谱柱时间不同，继而使各种类胡萝卜素得以分离和鉴定。

本研究应用酸热法提取红酵母油脂后，选用HPLC对其进行定性和定量分析，期望为红酵母提取类胡萝卜素提供一些技术参考，也为将来规模化生产中优良产油红酵母种质的筛选提供实验依据。

2材料与方法

2.1实验材料

红酵母材料来源于戴维斯种质库，菌种编号05-736，其不同培养状態见图l。经平板活化培养和三角瓶振荡培养所得红酵母发酵液，加以离心，收获菌体沉淀物，置于培养皿中放到恒温干燥箱中于50℃条件下烘干2h待用。

2.2实验方法

2.2.1酸热法提取油脂

①准确称取3份干菌体样品每份1.000g分别装入到3支试管。②加入6mL浓度为3mol/L盐酸于各试管中，然后充分混匀，静置30min后，再放于98℃恒温水浴锅中。③把上述的试管分别加入8mL的石油醚与丙酮比例为20：1溶液。④再把试管放于混匀器上充分混匀，放人离心管中，4000r/min离心20min。⑤取上清液放置到干燥的进样瓶中，氮吹仪吹干，称重。

2.2.1HPLC分离鉴定和量化类胡萝卜素

（1）流动相配置：流动相（A）：100L甲醇和甲基叔丁基醚和蒸馏水比例为（83：15：2），再加入3.9mL醋酸铵;流动相（B）：100L甲醇和甲基叔丁基醚和蒸馏水比例为（8：90：2），再加人2.6mL醋酸铵。

（2）流动相释放时间及比例，见表1。

（3）色谱柱规格为聚合色谱柱型号为C30，3um，150mm。

2.2.3油脂与类胡萝卜素称重与计算

（1）油脂称重与计算。将进样瓶编号称重，记为m1（g）（精确度0.001）;用氮气吹干装有油脂的进样瓶后，称重其重量记为m2（g）（精确到0.001）;油脂提取的计算公式：粗油脂重量M=m2-m1，则红酵母产油率的计算公式：

Y=M/S×100%（1）

式（1）中：M=粗油脂质量（g）;y=粗油脂含量（%），S=为红酵母干菌体质量（g）。

（2）类胡萝卜素鉴定与计算。利用高效液相色谱仪，根据4种类胡萝卜素保留时间不同，在计算机上所形成的峰值段与时间轴围成的面积，与各类胡萝卜素标准的峰面积比对，分析计算各种类胡萝卜素的种类及含量。

3结果与分析

3.1HPLC体系中8种类胡萝卜素标准的保留时间

8种类胡萝卜素标准的保留时间见表2。

3.2目标红酵母类胡萝卜素种类的分离及鉴定

由目标红酵母05-736经HPLC所得的色谱图（图2）可见，一共有7个有效峰值，其中在4.136min、23.756min、27.002min这三个时间段，不能确定是类胡萝卜素。而在17.483min、23.304min、26.192min、29.253min这四个时间段，对应了4种类胡萝卜素标准的保留时间，从而鉴定其分别为：β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、红酵母红素、圆酵母素。

3.3目标红酵母油脂与类胡萝卜素的定量分析

从表3可看出目标红酵母的粗油脂得率为51.21±3.59%;而其中β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、红酵母红素、圆酵母素的含量依次增高，与图2中所展示的四种类胡萝卜素峰值段围成的面积大小相符。与已有研究报道相比，该红酵母在油脂含量和类胡萝卜素含量上均表现出优势。

4结论

通过HPLC对目标红酵母菌株类胡萝卜素进行了分离鉴定，成功鉴定出4种胡萝卜素，即β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、红酵母红素和圆酵母素，并测得其在每克油脂中的含量分别为：48ug、60ug、206ug、544ug。在每克干菌体中的含量分别为23ug、29ug、98ug、259ug，实现了对该目标红酵母菌株类胡萝卜素的定性及定量分析，本研究可为红酵母提取类胡萝卜素工艺参数的优化与优良红酵母种质资源的筛选奠定基础。