应用减毒沙门菌载体递呈多糖抗原的研究进展

卞晓萍，刘 青，孔庆科

(西南大学动物科技学院，重庆北碚400715)

近年来，应用减毒沙门菌载体递呈异源抗原开发口服活疫苗受到广泛的重视。沙门菌作为活的疫苗载体，其优点有：(1)沙门菌疫苗通过常规的细菌培养方法即可大量获得，而且可以通过食物或饮水口服给药，是大规模养殖场接种疫苗的经济、方便选择；(2)经口服接种的减毒沙门菌能够通过粘膜途径感染宿主，诱发特异性粘膜、体液和细胞免疫应答[1]；(3)沙门菌可以在活细胞中生物合成多糖，并且这些多糖可以连接至类脂A (Lipid A)的核心寡糖部分，从而诱导针对异源多糖抗原的系统性免疫应答[2-3]。此外，使用延迟减毒系统能够兼顾减毒沙门菌疫苗的安全性和有效性。该系统的主要原理是，用可调控启动子(如阿拉伯糖调控子)将某些基因的启动子替换，在体外诱导条件下该基因可以正常表达，沙门菌可以如野生菌一样感染宿主，而一旦沙门菌到达缺乏诱导条件的体内环境，该基因不再表达，从而引起细菌毒力弱化[4]。外膜多糖是存在于大多数致病菌的一种毒力因子，经修饰后可以被用来预防相关致病菌引发的疾病。因此，使用减毒沙门菌载体开发多糖疫苗也是相关研究的热点之一。本文将对减毒沙门菌载体递呈异源多糖的研究进展及其潜在的免疫机制进行综述。

1 荷载多糖的减毒沙门菌诱发免疫的机制

经消化道感染宿主后，在肠道具有侵袭力的减毒沙门菌可以通过以M 细胞为代表的上皮细胞途径侵入皮下组织，然后被位于小肠上皮下穹窿区的抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)捕获，进而诱发机体的免疫应答[5]。而缺乏侵袭力的减毒沙门菌则需要依靠吞噬细胞的吞噬作用才能被运送到血液中，继而到达肝脏和脾脏并诱发相应的免疫应答[6]。

细菌的外膜多糖是非T 细胞依赖性抗原(TI 抗原)。虽然多糖抗原能在体内诱导特异性IgM 应答，但不能诱导大量IgM 转换为IgG，也不能诱导免疫应答增强(即记忆免疫后的二次抗体应答)和持续的T 细胞记忆。多糖抗原也不能与MHC-II 类分子结合，所以无法被递呈给T 辅助细胞(Th 细胞)，继而导致生发中心反应、B 细胞受体的相关同种型转换及亲合力成熟和记忆B 细胞的产生等免疫应答过程也无法发生。为了解决TI 多糖抗原无法诱导有效免疫应答的问题，Fikri 等将B 组链球菌III 型的荚膜多糖与蛋白载体(卵清蛋白，破伤风毒素或卵清蛋白肽)共价结合，发现多糖能够被APC 捕获并与MHC-II 类分子结合，然后激活Th 细胞，进而转化为T 细胞依赖性抗原(TD抗原)[7]。在多糖-蛋白载体共价结合的情况下，多糖抗原诱导特异性IgM 转换为IgG，记忆B 细胞发育和高效记忆T 细胞产生，从而诱发机体产生多糖抗原特异性、适应性免疫应答反应。

多糖- 蛋白载体进入体内后，能够被APC (如巨噬细胞、B 细胞、树突状细胞等)捕获，然后与APC 的受体结合并交联，进而通过胞吞作用(外源抗原递呈途径)被内化到核内体中。在溶酶体中，某些氧化剂如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)可以将多糖解聚为更小的碳水化合物(寡糖)，而蛋白质部分被酸性蛋白酶加工成短肽类。从而产生短肽、寡糖以及寡糖- 短肽复合物等。随后，寡糖- 短肽复合物的短肽部分被递呈至细胞表面并与MHC-II类分子结合，MHC-II 类分子将更亲水的寡糖递呈至CD4+T 细胞的 αβ 受体(T cellαβ receptor，TCRαβ)，TCRαβ 可以识别寡糖以及寡糖- 短肽复合物中的糖链。从抗原结合到APC 受体直至其被呈递给T 细胞，整个过程约需要30 min～60 min[8]。寡糖与MHC-II 类分子结合可以活化T 细胞，并诱发T 细胞产生白介素-4 (IL-4)和 IL-2 等细胞因子。在这些细胞因子的诱导下B 细胞开始在生发中心反应、诱导免疫球蛋白的同种型转换、体细胞高度突变以及记忆B 细胞的生成等。最终，机体产生针对寡糖的特异性IgG抗体(图1)。因此，通过多糖与蛋白载体的共价结合，可以将多糖抗原转化为TD抗原。

图1 多糖- 蛋白载体激活T 细胞的机制[7]

2 减毒沙门菌递呈异源多糖抗原的应用

2.1 减毒沙门菌载体的开发减毒沙门菌因其特殊的优势被广泛用于细菌、病毒、寄生虫以及肿瘤等方面的研究。与应用减毒沙门菌载体递呈蛋白抗原一样，用于递呈异源多糖的沙门菌也必须经过适当的毒力弱化。早期通过化学物质诱变和紫外线照射的方法使沙门菌减毒，但这两种方法存在很大的盲目性，可能存在未知的突变和回复突变，从而造成弱毒株的不稳定。如在20 世纪60年代初，房晓文等通过化学诱变的方法选育出预防仔猪副伤寒的减毒沙门菌疫苗，命名为C500[9]。该疫苗使用以来，我国的仔猪副伤寒得到了有效的控制，但同时该弱毒株的副作用较大，部分猪在接种后出现发抖，高烧甚至死亡。随着分子生物学技术的发展，目前大多数都采用基因工程的方法在沙门菌染色体中随机插入一个转座子或删除某些基因，以改变其编码的毒力因子或编码关键代谢途径的酶基因序列，以及控制菌株在体内生存的调节基因，使毒力基因突变，从而使其减毒，但不改变其免疫原性[10]。沙门菌的基因缺失途径可以分为营养缺失途径和代谢缺失途径。如芳香族氨基酸合成相关的aroA、嘌呤合成相关的pur、全局调控基因phoP/Q和cAMP 利用相关的crp/cya等。但是，在开发减毒沙门菌载体的同时，还应考虑到对沙门菌的毒力弱化要适度，既要保证安全性，又要避免过度减毒而影响其侵入机体、定植免疫器官和诱导有效免疫反应的能力。

首先，减毒沙门菌经口服免疫到达肠道后，需承受胃酸以及其它宿主防卫因子如胆碱，抗菌肽等的攻击，这对减毒沙门菌在肠道中的定植至关重要。研究表明，每种微生物均含有不同的耐酸反应(Acid tolerance response，ATR)系统，它能够使细菌在宿主体内耐受低酸环境，因此不同的微生物表现出不同程度的耐酸性。尽管沙门菌编码ATR1、ATR3 (精氨酸脱羧酶系统)、ATR4 (赖氨酸脱羧酶系统)和ATR5 (鸟氨酸脱羧酶)系统，但它仅具有中等耐酸性，可能是由于缺乏耐低酸的ATR2(谷氨酸脱羧酶系统)[11]。Kopecko 等为了提高伤寒沙门氏菌(SalmonellaTy21a，S.Ty21a)的耐酸性，在可调控的阿拉伯糖启动子诱导下将gad(谷氨酸依赖性耐酸基因)克隆到多拷贝质粒(pGad)中。pGad 在pH2.5 的低酸环境下复制3 h 后，将 Ty21a 的耐酸性增加了5 个对数，此时细菌在阿拉伯糖存在的条件下正常生长并且增强了耐酸性[12]。随后，该研究者为了gad基因能够100 %稳定表达，将该基因插入S.Ty21a 染色体中，并去除抗生素抗性标记。通过培养单核细胞/ 巨噬细胞，测定重组菌的生长曲线和存活率，结果表明：Ty21a中Gad 蛋白的表达不会对该重组菌的减毒产生任何影响。Wu 等以Ty21a 为载体递呈异源抗原开发二联苗，通过插入与异源抗原基因共表达的gad来构建重组耐酸菌，从而增强重组菌在胃酸性环境中的生存能力。动物实验发现，重组菌具有良好的耐酸性[13]。再者，减毒沙门菌还需通过定植在肠道细胞和其它细胞内，然后与免疫细胞作用诱导免疫反应。Kong 等应用阿拉伯糖调控的延迟减毒系统构建了减毒沙门菌，使沙门菌在进入体内(无阿拉伯糖环境)的早期阶段具有类似野生型沙门菌定植的能力，而定植到宿主后致弱，然后重组菌在阿拉伯糖缺少的条件下会进行程序式裂解，从而释放外源多糖抗原诱导相应的免疫应答[14]。最后，利用基因重组技术，可以将沙门菌开发为载体递呈异源多糖抗原。那么重组减毒沙门菌怎样才能诱发宿主产生针对异源多糖抗原的特异性免疫应答，这对开发多糖疫苗十分重要。目前，通用的方法是将整个多糖基因簇整合到沙门菌中。Han 等将禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenicEscherichia coli，APEC)O1 和 O2 抗原的整个基因簇整合到减毒沙门菌中，并且经动物实验发现重组菌能够诱发针对异源多糖抗原的免疫反应[2-3]。此外，由于沙门菌自身具有O- 抗原多糖，利用这一特性可以改造沙门菌自身的O- 抗原多糖合成基因，使其能够表达异源多糖抗原。Li 等改造减毒伤寒沙门菌的O- 抗原多糖基因簇，使其表达肠炎沙门菌的O9 多糖抗原，结果发现减毒伤寒沙门菌能够很好的表达异源多糖[15]。但这种方法要求异源多糖的结构与载体自身的O- 抗原多糖结构具有相似处，因而具有一定的局限性。

2.2 减毒沙门菌载体递呈的多糖减毒沙门菌载体的研究在国外很早就有报道，虽然近几年国内也有很多关于使用减毒沙门菌载体递呈异源抗原的研究，但所递呈的大部分都是蛋白类等抗原，关于异源多糖抗原的递呈鲜有报道。S.Ty21a 是国际上唯一许可的减毒沙门菌口服活疫苗，因其遗传背景较清晰，所以较多使用S.Ty21a 作为载体递呈多糖抗原。其次，减毒鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar typhimurium，S.typhimurium)载体也有较多研究。而对其它减毒沙门菌如猪霍乱沙门菌(Salmonella enterica serovar Choleraesuis，S.Choleraesuis)递呈异源多糖的报道几乎没有，除此之外减毒沙门菌所递呈的多糖抗原大都为革兰氏阴性菌的外膜多糖(表1)。

表1 减毒沙门氏菌载体递呈的异源多糖

外膜多糖位于细菌的表面，它直接与宿主相互作用，这大大增加了致病菌逃避免疫系统细胞的吞噬作用以及促进了致病菌的粘附等，因此多糖是一个重要的毒力因子。纯化的多糖不能诱导良好的免疫反应，但与蛋白载体共价结合后，可诱导较高的免疫反应，因此多糖也是一种重要的免疫因子。目前，异源多糖抗原在减毒沙门菌中的表达主要有两种方式。一种是将多糖基因簇整合到沙门菌的染色体中，另外一种是将编码多糖基因簇的质粒导入沙门菌中。由于沙门菌能够生物合成多糖，因此这两种方式均能够使多糖与沙门菌的Lipid A 连接，进而诱发机体产生针对异源多糖抗原的免疫应答。Dharmasena 等一直研究S.Ty21a 作为多功能口服疫苗载体，并尝试用它来递呈多种异源多糖抗原[16]。起初，他们将S.Ty21a 分别导入编码宋内志贺氏菌(Shigellasonnei)和痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)基因簇的质粒，所得到的重组菌在非选择性培养基中生长＞50 代后，仍然能够稳定携带这些质粒，但仍含有抗生素抗性标记。但删除抗生素抗性标记后，发现质粒表达变得不稳定。为此，研究者将编码S.sonneiLPS 基因簇的约12 kb 区域插入到由于突变而无功能的S.Ty21a 基因组中，构建了能够表达同源和异源O- 抗原的重组菌，并且在删除抗生素抗性标记后显示100 %的遗传稳定性。为了使减毒沙门菌载体诱发更广泛的免疫交叉保护，Dharmasena 等将噬菌体SfII 携带的bgt-gtrII 基因克隆到质粒的2a rfb 操纵子上游区，噬菌体SF6 携带的oac基因和噬菌体 SfX 携带的gtrX、gtrA和gtrB基因及其同源启动子串联克隆到质粒的2a rfb 操纵子上游区。通过上述方法得到的重组菌能够同时表达弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)2a 和3a O-抗原，并且能够诱发有效的免疫应答[18]。为了能够稳定表达外源多糖抗原，并诱发有效的免疫应答。Han 等用新型酵母细菌穿梭载体pSS26 克隆 10.8 kb 的 APEC O1 和 O2 O- 抗原多糖基因簇，并将所得到的质粒导入减毒鼠伤寒沙门菌载体中[2-3]。通过玻片凝集，银染和蛋白印迹等试验证实O1 和O2 O-抗原多糖能够在减毒鼠伤寒沙门菌中稳定合成。其结果还显示减毒沙门菌疫苗中产生的APEC O1 和O2 O- 抗原多糖能够附着于减毒沙门菌的表面，并且异源多糖抗原的存在不影响减毒沙门菌表面脂多糖等其它佐剂的表达。动物实验表明，该重组菌能够为禽类提供针对APEC O1 O2 抗原攻击的保护，并诱导针对异源多糖的高IgG 和IgA 免疫应答。新型酵母细菌穿梭载体的应用使异源多糖基因簇能够成功连接到沙门菌的Lipid A 并暴露于沙门菌的表面，这使重组菌能够诱发针对异源多糖的有效免疫应答。

将编码多糖基因簇的质粒导入减毒沙门菌中会面临质粒可能丢失的问题，而应用以营养选择标志代替抗生素抗性标志为主要特征的宿主- 载体平衡致死系统能够使外源基因在宿主菌中稳定表达。目前，应用较多的是asd宿主- 载体平衡致死系统。该系统的原理是：asd基因负责编码的天冬氨酸B- 半醛脱氢酶，是沙门菌的赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、二氨基庚二酸(DAP)合成途径中的一种关键酶，DAP 是构成沙门菌细胞壁中肽聚糖的基本成分，是保持细胞完整性不可或缺的物质。asd基因发生突变后，沙门菌由于不能合成DAP 而导致溶菌死亡[24]。当导入带有asd完整基因的互补质粒后，质粒与缺陷菌株能够以遗传互补的方式共同构成宿主- 载体平衡致死系统，含有互补质粒的缺陷菌可在体内复制。此时，互补质粒对其宿主菌的生长成为必需，一旦质粒丢失，沙门菌则由于不能合成必需物质而死亡，因此凡是能在体内生长的缺陷菌株必定含有重组质粒[25]。除此之外，编码胸腺嘧啶核苷酸合成酶的thyA基因、编码谷氨酰胺合成酶的glnA基因等平衡致死系统也有应用，其原理与asd宿主载体平衡致死系统类似[25]。

3 问题与展望

多糖疫苗在20 世纪80年代末首次用于人体免疫。b型流感嗜血杆菌(Hib)一直是引起细菌性脑膜炎的主要原因，但多糖疫苗上市后病原体引起的脑膜炎发病率降低95 %。这一巨大成功为进一步研究多糖疫苗打开了大门。2005年以后，我国至少有4 个以上厂家制造的Hib 结合疫苗先后注册上市。但是，国产的Hib 结合疫苗普遍采用溴化氢活化荚膜多糖或其衍生物与蛋白共价结合来制备疫苗，结合方法过于单一、制造成本高且有着显著的局限性(如免疫原性较差、不能提供群体免疫力等)[26]。而用减毒沙门菌载体递呈异源多糖抗原构建多糖疫苗，其载体本身具有免疫佐剂作用。例如，LPS 的刺激可以增强树突状细胞捕获和加工MHC-Ⅰ类抗原的能力，有利于将重组沙门氏菌的抗原递呈给特异性的B、T 细胞[5]。而且，定植的减毒沙门菌可以持续地表达外源多糖抗原、刺激宿主，不需要反复免疫。此外，沙门氏菌是胞内侵袭菌，能够激活相应的细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)，经纯化并共价结合的蛋白-多糖则没有此作用。

在过去的十几年里，对减毒沙门菌载体的研究向前跨越了一大步。已经有不少实验证实了减毒沙门菌载体递呈异源多糖的潜力，但其真正用于临床还需解决几个问题。减毒沙门菌载体的安全性是首先需要考虑的。如果未经充分减毒，经口服途径给药的沙门菌可能在宿主体内大量增植并造成严重的毒副作用。针对这种情况，可以考虑应用可调控的延迟减毒系统，该系统的应用使沙门菌充分减毒的同时又能保持其良好的侵袭力与定植[27]。总之，在对沙门菌减毒的同时，既要保证其安全性，又要保证其良好的免疫原性。其次，如其它载体一样，减毒沙门菌用于递呈异源多糖也需要考虑递呈效率。酵母细菌穿梭载体可以用于克隆表达多糖基因簇，该方法的主要原理在于利用酵母能在体内组装同源片段(酵母具有复制子ARS4 和CEN5以及原核复制子pSC101)，然后形成大质粒的特性(该质粒具有TRP、Spec、asd 的筛选标记，可以实现在酵母和原核宿主中的筛选，可以同时容纳多个DNA 片段用于克隆长片段DNA 或基因簇的克隆和稳定表达)，再结合沙门菌的低拷贝质粒能容纳大片段的特性及专门用于疫苗递送的质粒载体即平衡致死系统组合而成的这一种方法。此外，载体与多糖之间的相互作用仍需进一步研究，这对应用减毒沙门菌载体开发多糖疫苗成功应用到临床至关重要。例如，沙门菌自身的O- 抗原多糖对异源多糖的表达是否有影响、减毒沙门菌载体递呈异源多糖对其糖链的修饰有何影响以及多糖与lipidA 连接后诱发机体免疫的机制都尚不清楚。本实验室正着力于优化重组减毒沙门菌载体，并尝试以沙门菌为载体来递呈不同的多糖抗原，以开发安全有效的、可用于递呈异源多糖的沙门菌疫苗。

虽然以减毒沙门菌为载体开发多糖多价疫苗还未达到预期的成果，但应用沙门菌开发多糖多价疫苗有着诸多的优点和潜力，仍值得继续研究。相信随着相关研究的进一步深入以及现代生物学技术的不断发展，当前遇到的问题将来都可以得到解决。