福建省14株PRRSV-2全基因组特性分析

魏春华，夏 伟，马 英，李 娜，吴熠丹，勾明郗，林志峰，戴爱玲，杨小燕，刘建奎

(龙岩学院生命科学学院福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室/ 福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩364000)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由 PRRS 病毒(PRRSV)引起的一种高度传染性疾病，主要以母猪繁殖障碍及仔猪严重的呼吸道疾病为主要特征，给世界养猪业造成了重大的经济损失[1-2]。2006年国内暴发的高致病性PRRS (Highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)给中国的养猪业造成了重大的经济损失[3]。2013年左右我国出现了引起妊娠母猪严重流产和仔猪呼吸系统疾病的新流行株NADC30-like PRRSV[4-8]。近年来小范围流行的谱系3 (Lineage 3)的病毒株，进一步加大了对PRRS 的防控难度。Shi 等对全球8624 份PRRSV ORF5 基因序列进行分析，将PRRSV-2 分为9 个谱系(lineage)：1～9，每个谱系的病毒株又可划分为不同的亚型[9]。研究显示，目前我国PRRSV 分为4 个谱系：lineage 1、lineage 3、lineage 5.1 和lineage 8[10-11]。 HP-PRRSVs 和 CH-1a-like PRRSV 属 于lineage 8.7， NADC30-like PRRSV 属 于 lineage 1，VR2332、RespPRRS MLV 等经典株属于lineage 5.1，QYYZ 和 GM2 病毒株属于lineage 3。

福建省是养猪大省，生猪贸易比较发达，PRRS已严重阻碍了当地养猪业的健康发展，为了进一步了解福建省PRRSV 遗传变异特性，本研究选取不同谱系的福建省14 个病毒株(lineage 3、lineage 8.7、lineage 5.1 和lineage 1)进行病毒分离及全基因组分析，为防控PRRS 提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 PRRSV 来源与主要试剂14 个病毒株(lineage 3 中的 1 株、lineage 8.7 中的 5 株、lineage 5.1 中的1 株和lineage 1 中的7 株)分离自福建省不同地市不同年份的疑似PRRS 发病猪场(表1)。MARC-145 细胞和肺泡巨噬细胞(PAMs)由龙岩学院生命科学学院重点实验室保存。RNA 提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；Superscript III reverse transcriptase 和Platinumpfx DNA polymerase 购自 Invitrogen 公司；山羊抗鼠FITC-lgG 荧光抗体购自美国Sigma 公司；PRRSV N蛋白单克隆抗体(MAb)为本实验室制备与保存。

1.2 病毒全基因组的克隆、测序及序列分析按照试剂盒说明书提取各病毒RNA，反转录为cDNA 后以其为模板，参考魏春华等[6]和Leng 等[12]的方法对PRRSV 全基因组进行分段扩增。纯化后的目的片段克隆至pEASY-T1 Cloning Kit 中，挑取阳性重组菌送往北京睿博测序公司进行测序。采用MEGA 6.0软件中的邻近法(Neighbor-joining tree with 1000 bootstrap)对PRRSV 全基因组进行遗传进化分析。

表1 福建省14 个PRRSV-2 序列信息Table 1 Overview of the complete genomes of 14 PRRSV-2 isolates from Fujian procvince

1.3 重组分析利用Recombination Detection Program v.4.24 (RDP 4.24)和 Simplot 3.5.1 软 件 对PRRSV 可能的重组事件进行检测和分析[7]。

2 结果与讨论

2.1 PRRSV 基因组特性分析经拼接后对14 个PRRSV 分离株的基因组进行分析，结果显示福建省14 株PRRSV 基因组去除poly(A)后的长度为15 016 bp～15 407 bp (表 1)。基因同源性分析显示 14 株PRRSV 与VR2332 的核苷酸序列同源性为85.0 %～99.4 %，与CH-1a 的核苷酸同序列源性为84.2 %～95.0 %，与JXA1 的核苷酸序列同源性为83.4 %～99.2 %，与NADC30 的核苷酸序列同源性为82.9 %～97.1 %。福建省NADC30-like PRRSV 基因组核苷酸序列与现有的疫苗株同源性差异较大，致使PRRSV 疫苗对NADC30-like 株的交叉保护力不强，从而导致该类病毒株在福建省，甚至全国大规模暴发[13-14]。同时 NADC30-like PRRSV 与 NADC30 的核苷酸同源性呈逐年降低的趋势， 而与国内HP-PRRSV 代表株 JXA1、HuN4、NT1、NT2 等和经典株CH-1a 的核苷酸同源性呈现上升的趋势，这可能与NADC30-like PRRSV 与HP-PRRSV 频繁发生重组有关。FJZH、FJCH 与JXA1-R 疫苗株的核苷酸同源性最高为99.5 %～99.6 %，而与JXA1 核苷酸同源性为99.1 %～99.2 %，表明FJZH、FJCH 可能来源于疫苗株。

2.2 PRRSV 5'-UTR 和3'-UTR 的序列分析福建省 14 个病毒株 5'-UTR 长度为 189 bp～190 bp，与参考株的核苷酸同源性为88.4 %～100 %，而与EU-type 代表株LV 的核苷酸同源性为39.9%～63.5%。5'-UTR 的start motif 和UUAACC 转录调控序列在所有的病毒株中高度保守。14 个病毒株的3'-UTR 高度保守的转录调控序列(UUAACC)未发生变异，长度为148 bp～151 bp，与参考株的核苷酸同源性为84.7 %～100 %，而与EU-type 代表株LV 的核苷酸序列同源性为69.9 %～76.3 %。与VR-2332 相比，FJZ03 等 7 个病毒株 3'-UTR 长度为 148 bp，在aa118～aa120 存在一个独有的缺失区域，与国内其它 NADC30-like PRRSV 和 HP-PRRSV 不同，表明PRRSV 3'-UTR 存在较大程度的变异，这是否会影响病毒的复制有待进一步研究。

2.3 分离株Nsp2、ORF5 和ORF7 基因推导氨基酸序列分析Nsp2 是PRRSV 基因组中变异最大的非结构蛋白，是PRRSV 重要的分子遗传标志，也是不同类型病毒株分型的分子标志。利用MegAlign软件对14 个PRRSV 与参考株Nsp2 基因推导氨基酸序列进行了比对。结果显示，与参考株VR2332 相比，FJZ03、FJY04、FJM4、FJL15 和 FJWQ16 病毒株的Nsp2 基因具有NADC30-like PRRSV 的分子标志 ，存 在 131aa (aa322 ～aa432、 aa483 和 aa504 ～aa522)不连续缺失，表明5 个毒株为NADC30-like PRRSV。

以VR2332、NADC30 和JXA1 为参考序列，对14 个PRRSV 的GP5 基因的抗原位点进行分析。结果显示，GP5 N 端抗原位点(aa37～aa51、aa149～aa156、aa166～aa181 和 aa192～aa200)高度保守，而位于C 端抗原位点(aa1～aa15 和aa27～aa35)变异程度较大。Tce60～74 和 Tce149～163 两个 T 细胞表位区高度保守，而Tce149～163 变异程度较大。在已证实的糖基化位点中，N44 和N51 高度保守，未发生氨基酸的替换，NADC30-like PRRSV 在N35 位丢失一个糖基化位点。与参考株比对分析，显示NADC30-like PRRSV 存在几处独有的氨基酸突变：L47I、N/V94I、V/I124A 和 E168D。

将福建省14 个PRRSV N 蛋白氨基酸序列与参考株进行比对分析，显示NADC30-like PRRSV 存在几处独有的氨基酸突变：K7R、K10N、N34S/R、K48R和Q80R。N 蛋白的共价作用通过在保守的第23 位氨基酸处形成二硫键，非共价作用则与aa30～aa37 密切相关，NADC30-like PRRSV 存在N34S/R 的突变，可能会影响N 蛋白的空间构象[15]。由于PRRSV N蛋白具有高度的免疫原性，因此N 蛋白是检测PRRSV 最合适的靶蛋白，PRRSV NADC30-like 株N蛋白与参考株相比，存在多个氨基酸位点的突变，其是否会对血清学检测方法产生影响需要进一步研究。

2.4 PRRSV 分离株遗传进化分析和重组分析将14 个PRRSV-2 的全基因组序列及ORF5 基因序列分别与33 株国内外参考株进行比对分析，构建系统遗传进化树(图1)。结果显示，14 株PRRSV 分为5 个亚群(I-V)，I 亚群包括FJZH、FJCH、FJOU、FJYR、FJW05 和FJXS15，该亚群与HP-PRRSV 代表株 JXA1、HuN4、NT1、HUB1 等处于同一分支。研究表明，2006年之后我国猪场流行的病毒株主要为HP-PRRSV，因此大部分养殖户选择HP-PRRSV 疫苗进行免疫，致使疫苗株长期在猪场存在，在选择性免疫压力下可能会导致疫苗株突变为毒力较强的病毒株[16]。本研究中FJZH 和FJCH 分离于两个长期接种JXA1-R 疫苗的猪场，该两个病毒株与疫苗株JXA1-R 亲 缘 关 系 较 近 ， 而 与 JXA1、 HuN4 等HP-PRRSV 亲缘关系稍远，表明这两个病毒株可能来源于疫苗株JXA1-R。II 亚群包括FJE1 和香港分离株HK1、HK13，该亚群处于HP-PRRSV 与HB-1(sh)/2002 之间。FJFS 病毒株属于III 亚群，与广东分离株QYYZ 和GM2 处于同一分支，该亚群病毒株为福建省首次发现，可能由广东省传入福建省。FJSD 属于 IV 亚群，与 VR2332、BJ-4 和 RespPRRS MLV 处于同一分支。PRRSVs NADC30-like 属于V亚 群 ， 包 括 FJZ03、 FJY04、 FJM4、 FJL15 和FJWQ16，与NADC30、MN184 病毒株的亲缘关系较近，尤其与NADC30 亲缘关系最近，推断其由NADC30 株衍化而来。FJW05 和FJXS15 在全基因组构建的遗传进化树中为HP-PRRSV，而在基于ORF5基因序列构建的遗传进化树中为NADC30-like PRRSV (图1)，提示 FJW05 和 FJXS15 可能为重组病毒。

图1 14 株分离株(▲)全基因组(A)和 ORF5 基因(B)与参考毒株系统进化树分析Fig.1 Phylogenetic trees based on complete sequence (A)and ORF5 gene (B)of PRRSV-2 isolates from Fujian and reference strains

利用Simplot 3.51 软件和RDP 4.24 软件对福建省 PRRSV 进行重组分析，结果显示 FJW05 和FJXS15 存在重组现象，重组位点位于Nsp2 (nt1092)和ORF4 (nt13771)中，该两个断点将两个病毒株基因组分为3 个区域，断裂点(nt1092)前和断裂点(nt13771)后的区域与JXA1-R 亲缘关系最近，而nt1093～nt13770 区域与 NADC30 亲缘关系最近(图2A)，表明 FJW05 和 FJXS15 是 NADC30 与 JXA1-R重组产生的新型病毒株。FJWQ16 株也存在重组现象，重组位点分别位于Nsp7(nt6949)和Nsp9(nt8894)中，断裂点(nt6949)前和断裂点(nt8894)后的区域主要来自于NADC30，而nt6950～nt8893 区域主要来自于 JXA1 (图2B)，表明 FJWQ16 是 NADC30 与JXA1 重组产生的新型毒株。

图2 PRRSV FJW05、FJXS15(A)和 FJWQ16 (B)株的重组分析示意图Fig.2 Genome recombination analysis of FJW05, FJXS15 (A)and FJWQ16 (B)

研究表明部分猪场经常存在两种或两种以上的PRRSV，从而造成PRRSV 重组的现象时有发生[17-19]。通过重组分析软件和遗传进化树分析表明FJW05 和FJXS15 两个病毒株可能来自JXA1-R 株和NADC30-like PRRSV 之间的重组，这两株病毒在PAMs 和MARC-145 细胞中具有更强的适应能力，可能会导致其在猪群中快速传播和长期存在。鉴于疫苗株和野毒株存在一定的重组概率，因此猪场在防控PRRS 时，不能只依靠疫苗进行防控，应加强猪场的生物安全措施，定期对猪场的PRRSV 抗原进行检测，必要时要从全基因组角度进行病原分析，不能只根据单个基因进行分析。