醋泡方法对黑豆皮中花色苷的提取量及其生物活性的影响

李甘，李勇，王创建，杜芳芳，双少敏*

(1.山西大学 化学化工学院，山西 太原 030006;2.山西大学 环境科学研究所，山西 太原 030006)

0 引言

黑豆(Glycinemax)又称乌豆，是我国传统种植的农作物。黑豆不但营养价值高，而且具有药用价值[1]。《本草纲目》中记载：“常食黑豆，可百病不生”，具有滋补肝肾，软化血管等功效[2-3]。

黑豆种皮中因含有丰富的花色苷类物质而呈现黑色。花色苷是赋予植物颜色的天然水溶性色素，属于类黄酮化合物。研究报道已从黑豆皮中分离得到了多种花色苷，其中矢车菊素 3-O-葡萄糖苷是黑豆皮中最主要的活性成分之一[4-6]。花色苷作为黑豆皮色素的主要成分，除了具有很强的抗氧化能力[7]，能有效清除体内自由基，还有降血糖[8]、抗癌[9]、抑制脂肪[10-11]等活性，其中降血糖作用引起了学者们的高度关注。研究糖尿病的过程中发现，α-葡萄糖苷酶抑制剂在2型糖尿病的治疗过程中发挥着重要作用，是近年来糖尿病药物开发研究的一个热点[12]。

近年来，醋泡黑豆作为一种功能性保健食品引起广泛关注，因其集合了黑豆和陈醋的营养和保健作用。有关醋泡黑豆的制备条件和功能特性变化方面的研究已有报道[13-15]。熊太银等[13]采用正交试验和改良试验探索醋泡黑豆的最佳工艺参数，研制出适合大众口味的黑豆休闲食品。张月圆等[16]研究醋浸可改变黑豆各蛋白组分的含量和对应多肽的ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性。江帆等[15]表明醋泡黑豆制备条件对醋泡黑豆的抗氧化特性有显著影响。但有关醋泡黑豆皮的研究尚少见报道。本文研究了醋泡方法对黑豆皮中矢车菊素3-O-葡萄糖苷的提取量及黑豆皮提取物的抗氧化能力和对α-葡萄糖苷酶的抑制能力的影响，为黑豆皮花色苷的开发利用提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑豆皮、白醋选购于太原市蓝海农贸市场。

花色苷标准品：矢车菊素3-O-葡萄糖苷(Cy3-O-glu)购于挪威多酚公司；乙醇、甲醇、盐酸、石油醚、乙酸乙酯，均为分析纯。高效液相色谱(HPLC)所用甲醇(色谱级)，2, 2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)，阿卡波糖水合物购于阿拉丁公司。α-D-葡萄糖苷酶[EC 3.2.1.20]，4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷(4-MUG)购自西格玛奥德里奇公司。

1.2 仪器

安捷伦HPLC-1200高效液相色谱仪(配有四元泵、自动进样器、可变波长紫外检测器和色谱工作站)，荧光光度计(英国，爱丁堡公司)，紫外-可见分光光度计(珀金埃尔默仪器上海有限公司)，旋转蒸发仪(Heidolph/G3)，超声波清洗器(天鹏电子新技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 矢车菊素3-O-葡萄糖苷标准溶液配制

准确称取标准品花色苷Cy 3-O-glu 2.00 mg，将其溶于2.00 mL 含体积分数为1%盐酸的甲醇溶液中，配成1.00 mg/mL的标准储备液。从标准储备液中吸取一定量，用体积分数为1%盐酸的去离子水溶液稀释成：5、50、100、250、500 μg/mL标准品待测液，用0.45 μm滤膜过滤，取20 μL上样。

1.3.2 花色苷的提取

1.3.2.1 黑豆皮花色苷的提取

称取黑豆皮样品20 g，加入200 mL含体积分数为1%盐酸的乙醇溶液，室温下超声处理3次，每次15 min；布氏漏斗过滤，得滤液。滤渣再用200 mL体积分数为1%盐酸的乙醇溶液重复提取2次，将3次滤液合并，40℃下真空浓缩去除乙醇，然后用体积分数为1%盐酸的去离子水定容至5 mL，于冰箱中冷藏备用。

1.3.2.2 醋泡黑豆皮花色苷的提取

称取黑豆皮样品20 g，使用白醋浸泡2 d[13]。重复以上提取步骤，最终用体积分数为1%盐酸的去离子水定容至5 mL，于冰箱中冷藏备用。

1.3.3 检测波长的确定

用体积分数为1%盐酸水溶液配制少量黑豆皮提取液，用紫外可见分光光度计200 nm～800 nm的范围内对其进行扫描，得黑豆皮提取液的吸收光谱图。同时对标准品花色苷溶液，用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描，得到花色苷Cy 3-O-glu吸收光谱图，确定其最大吸收波长。

1.3.4 色谱条件

色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)。流动相A为水(含体积分数为0.1%的甲酸)，流动相B为甲醇。流速1 mL/min，进样量20 μL，柱温30℃，检测波长520 nm。梯度条件：0～50 min，5%～100%B；50～60 min，100%B 冲柱。

1.3.5 加标回收率的测定

准确称取已知花色苷Cy 3-O-glu含量的黑豆皮原料20 g，准确称取3份，分别加入与供试样品中花青素含量相同的花色苷Cy 3-O-glu对照品，按1.3.2中花色苷的制备方法制备，按 1.3.4中确定的方法准确测定，计算平均回收率。

1.4 生物活性的测定

1.4.1 抗氧化活性-ABTS法

ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+，在抗氧化物存在时ABTS+的产生会被抑制，因其在734 nm或405 nm有最大吸收，所以一般选择734 nm或405 nm测定ABTS的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。

参照Bellumori等[17]的方法使用ABTS+模型测定黑豆皮花色苷的抗氧化活性。取100 μL的样品溶液加入2 mL ABTS溶液避光反应2 min，空白实验取100 μL水加入2 mL ABTS溶液避光反应2 min，然后测定在734 nm处吸光度值。以维生素C作为阳性对照。根据不同浓度的样品的清除率可计算出半抑制浓度IC50。

依据公式(1)，可以计算出ABTS+的清除率：

(1)

A0为空白溶液的吸光度值，At为样品与ABTS 反应后的吸光度值。

ABTS溶液的配置：称取54.8 g ABTS溶于20 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.0)，加入1 g的MnO2，活化20 min。取2 mL活化好的溶液离心，用磷酸缓冲溶液稀释上清液，使其A734(t0)=0.800±0.02 nm。

1.4.2 抗氧化活性-DPPH法

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)是一种很稳定的氮中心的自由基，当有自由基清除剂的存在时，由于与其单电子配对而使其在517 nm处的吸收消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可使用分光光度计进行快速定量分析。

参考Zill-E-Huma[18]的方法使用DPPH+模型测定黑豆皮花色苷的抗氧化活性。称取40 mg的DPPH溶于100 mL的甲醇中，50 μL的样品溶液与2 mL的DPPH溶液避光反应30 min，空白实验取50 μL水与2 mL DPPH溶液避光反应30 min。在517 nm处测量吸光度值，以维生素C作为阳性对照。根据不同浓度的样品的清除率可计算出IC50。

依据公式(2)，可以计算出DPPH+的清除率：

(2)

A0为空白溶液的吸光度值，At为样品与DPPH 反应后的吸光度值。

1.4.3α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以4-MUG为反应底物，4-MUG被α-葡萄糖苷酶水解后产生的4-甲基伞形酮(4-MU)具有荧光，可被检测。而α-葡萄糖苷酶抑制剂的存在会抑制4-MUG的水解，减少4-MU的产生。通过测定样品加入前后荧光变化可以判断出黑豆皮提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响[12,19]。

按照廖晖等[12,20]的方法测定样品的α-葡萄糖苷酶的抑制作用。将黑豆皮花色苷提取物20 μL与40 μL制备的1 μg/mL酶溶液和50 μL 10 mmoL/L 4-MUG溶液在Tris缓冲液(pH 6.9)。将混合物摇匀，在37℃温育20 min。在λex380 nm，λem400 nm处测定荧光值。α-葡萄糖苷酶对照组含有缓冲液20 μL，底物溶液50 μL和酶溶液40 μL；空白组含有黑豆皮花色苷提取物20 μL，缓冲液20 μL和酶溶液40 μL，而空白对照组含有缓冲液和酶溶液。阿卡波糖为阳性对照。根据不同浓度的样品的抑制率可计算出IC50。

依据公式(3)，可以计算出α-葡萄糖苷酶的抑制率：

(3)

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

图1a是标准品Cy 3-O-glu在体积分数为1%盐酸水溶液中的吸收光谱图，从谱图中可以发现其在 520、360、280 nm处有吸收峰。图1b是黑豆皮提取物在体积分数为1%盐酸水溶液中的吸收光谱图，从谱图中可以看出黑豆皮提取物分别在520、360、280 nm处有吸收峰，而 520 nm为花青素类色素的特征吸收峰。因此，选择520 nm作为黑豆皮提取物中花色苷HPLC的检测波长。

Fig.1 UV-visible absorption spectrogram of Cy 3-O-glu (a), black soya bean hulls extraction (b)图1 标准品花色苷Cy 3-O-glu(a)，黑豆皮提取液(b)的紫外-可见吸收光谱图

2.2 黑豆皮花色苷的鉴定

图2为醋泡前后黑豆皮花色苷提取物以及标准品Cy 3-O-glu的HPLC谱图。经HPLC谱图分析，并与标准品(图2a)进行对比，确定峰1为Cy 3-O-glu。

Fig.2 HPLC chromatograms of Cy 3-O-glu (a), untreated soybean skin (b) and vinegar soak black soybean hulls (c)图2 标准品花色苷Cy 3-O-glu(a)，未处理黑豆皮(b)及醋泡黑豆皮(c)的HPLC色谱图

2.3 方法性能指标

2.3.1 线性关系与检测限

由1.3.1配置的标准系列溶液在1.3.4的色谱条件下，经HPLC测得Cy 3-O-glu的标准系列溶液的色谱峰的峰面积。以Cy 3-O-glu的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归分析，绘制标准曲线。结果表明Cy 3-O-glu在5 μg/mL～500 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为：Y=29.668x+125.96，R2=0.999 1，标准曲线如图3所示。

经HPLC测定，当花色苷Cy 3-O-glu峰高为仪器响应噪声的3倍量时，检测限为50 ng/mL( S/N=3)。

2.3.2 精密度的测定

取浓度为100 μg/mL标品待测液，连续进样5次，每次进样20 μL。通过HPLC测得的花色苷Cy 3-O-glu的峰面积，计算RSD为0.6%。结果说明仪器具有良好的精密度。

2.3.3 稳定性的测定

取黑豆皮提取液分别于放置0、2、4、8、12 h后各进样一次，通过HPLC测得的花色苷Cy 3-O-glu的峰面积，计算RSD为0.6%。结果表明在12 h内样品具有很好的稳定性。

Fig.3 Standard curve of Cy 3-O-glu图3 花色苷Cy 3-O-glu标准曲线

2.3.4 重复性的测定

准确称取同一批黑豆皮5份，每份均为20 g。重复样品的提取操作，即1.3.2.1的操作。通过HPLC测得的花色苷Cy 3-O-glu的峰面积，计算RSD为2.8%。结果表明该实验具有良好的重现性。

2.3.5 加标回收的测定

按1.3.2中花色苷的制备方法制备并测定。平均回收率为96.47%，计算RSD为1.25%，结果如表1所示。结果表明该实验回收率良好。

2.4 醋泡黑豆皮前后花色苷的含量测定

黑豆皮花青素提取液按1.3.2 中样品处理方法制备，通过HPLC测定醋泡前后2个供试样品，可以得到花色苷Cy 3-O-glu的峰面积，通过标准曲线计算得到样品中花色苷Cy 3-O-glu的含量，结果见表2。此外，通过色谱谱图分析，醋泡黑豆皮(图2c)峰1的峰面积比未处理的黑豆皮(图2b)的峰1峰面积高出很多。结果表明，醋泡方法可以提高黑豆皮花色苷提取物中Cy 3-O-glu的含量。

表1 样品回收率的测定(n=3)

表2 不同工艺的黑豆皮花色苷Cy 3-O-glu含量的测定(n=3)

2.5 生物活性的测定及比较

2.5.1 醋泡前后黑豆皮提取液抗氧化活性的测定及比较

通过测定某物质清除自由基的能力，即可表征其抗氧化活性强弱[21-22]。由于同一种具有抗氧化活性的物质在不同的抗氧化测定体系中表现出的抗氧化活性不同，因此全面地评价一种物质的抗氧化能力不能只采用一种评价方法。因此，采用了ABTS，DPPH两种方法进行抗氧化活性的分析。

图4、图5分别显示了醋泡处理前后黑豆皮花色苷提取物及对照品维生素C对ABTS+和DPPH+的清除效果。黑豆皮花青素提取物和维生素C对ABTS+，DPPH+均有清除作用，且清除率与质量浓度均呈线性相关，即随着质量浓度的增加，自由基的清除能力增强。样品以及对照品对两种自由基清除能力的半抑制量IC50通过回归方程得到，列于表3中。

Fig.4 ABTS radical scavenging activities of anthocyanins fromblack soybean hulls with different technologies (a) and vitamin C (b)图4 不同工艺黑豆皮花青素以及维生素C的ABTS自由基清除能力

Fig.5 DPPH radical scavenging activities of anthocyanins fromblack soybean hulls with different technologies (a) and vitamin C (b)图5 不同工艺黑豆皮花青素以及维生素C的DPPH自由基清除能力

Fig.6 Inhibition of a-glucosidase of anthocyanins fromblack soybean hulls with different processes (a) and acarbose (b)图6 不同工艺黑豆皮花青素以及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力

表3 不同工艺的黑豆皮花色苷生物活性的IC50值

两种自由基的清除作用均有以下的趋势，IC50值从小到大为：醋泡黑豆皮<未经处理黑豆皮<维生素C。醋泡黑豆皮花青素提取物对ABTS+，DPPH+清除能力的IC50分别为阳性对照的5.92和1.83倍。结果显示DPPH法的清除能力低于ABTS法，这是由于DPPH比ABTS有更强的选择性，它不与B环上无羟基的黄酮类物质发生反应。综上分析，两种自由基清除的结果说明黑豆皮花色苷的抗氧化能力远高于维生素C，且醋泡黑豆皮极大提高了其抗氧化能力。

2.5.2α-葡萄糖苷酶抑制能力的测定及比较

黑豆皮花色苷提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响结果如图6所示。醋泡处理前后黑豆皮花色苷提取物及对照品阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶均有抑制的效果，且抑制率与质量浓度均呈线性相关，即随着质量浓度的增加，对α-葡萄糖苷酶的抑制能力增强。样品以及对照品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力的IC50通过回归方程得到，列于表3中。IC50值从小到大依次为：阿卡波糖<醋泡黑豆皮<未经处理黑豆皮。醋泡前后黑豆皮花色苷提取物的IC50值低于阿卡波糖，可能因为黑豆皮花青素提取物未经纯化，存在其他物质影响了其抑制能力。结果说明黑豆皮花色苷有作为α-葡萄糖苷酶的抑制剂的潜力，而较于未处理的黑豆皮，醋泡黑豆皮可显著提高对α-葡萄糖苷酶的抑制能力。

3 结论

本文研究了醋泡对黑豆皮中花色苷Cy 3-O-glu提取量的影响及对花色苷提取物生物活性的影响。结果表明，Cy 3-O-glu为黑豆皮提取物中的主要活性成分之一，醋泡黑豆皮可提高提取物中Cy 3-O-glu的含量。生物活性测定的结果表明，与未醋泡的黑豆皮相比，醋泡黑豆皮提取物对自由基清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制能力较强。综上所述，醋泡黑豆皮可极大提高抗氧化能力和对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，可作为一种潜在的天然抗氧化和降血糖资源，具有开发为预防糖尿病及其并发症的保健品的潜力。