杂粮早餐粉对砷致小鼠肝脏毒性的拮抗作用

李雅涛,仪慧兰

(山西大学 生命科学学院,山西 太原 030006)

砷(As)是自然界中分布广泛的一种类金属元素。人体摄入As的主要途径之一是饮用含砷水。全球有超过2亿人饮用水As含量超过WHO的最高限值10 μg/L[1],我国新疆、内蒙古和山西等省份均存在饮用水砷超标地区[2]。

居民饮用水As含量超标严重威胁身体健康,长期饮用含As水会引发机体多系统损伤,增加生殖、神经、心血管系统和Ⅱ型糖尿病的患病率,出现肝损伤、肝纤维化等[3-5]。As进入人体后主要在肝脏中进行甲基化代谢[6],五价的砷酸盐可被谷胱甘肽(GSH)还原成三价亚砷酸盐,之后经氧化甲基化生成一甲基砷酸盐(MMAV),MMAV经还原生成一甲基亚砷酸盐(MMAⅢ),MMAⅢ进一步氧化甲基化生成有机砷化合物二甲基砷酸盐(DMAV),在GSH作用下DMAV被还原生成二甲基亚砷酸盐(DMAⅢ)[7]。As在细胞内的甲基化代谢过程产生了大量活性氧自由基(ROS),还消耗细胞内源性GSH和硫氧还原蛋白[7]。As暴露导致肝脏组织中ROS水平升高,体内的氧化还原平衡被打破,引起组织细胞的氧化应激,继而出现肝脏组织损伤[6,8]。

基于对As毒性作用过程的认知,采用维生素C(VC)、维生素E(VE)、葡萄籽提取物等抗氧化剂缓解砷毒性取得一定效果[5,9],但有关利用饮食干预慢性As中毒的报道鲜见。因此,探索通过饮食调节预防慢性As中毒是一条新的有效途径。本研究以课题组利用山西省特色产品小米和核桃为原料配制的早餐粉作为干预食物,观察其对饮水型As染毒小鼠肝脏损伤的影响,以期为科学饮食预防As毒性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 杂粮早餐粉冲剂的配制

选用小米和核桃为原料,将各原料采用不同的焙烤时间熟化,通过混料设计的方法,用“双盲法”进行感官评分[10],以感官评分为评价指标,获得早餐粉最佳配方(质量百分比):小米29.9%、核桃19.70%、黄豆23.00%、白糖24.40%、黄原胶3.00%。将烘烤熟化的原料粉碎,过80目筛后按比例混匀。早餐粉样液的配制:取1 g早餐粉加水温高于90℃的水7 mL或14 mL拌均,既为14.3%或7.15%(质量/体积)的早餐粉冲剂。

1.2 实验动物分组与处理

选用昆明种雄性小鼠40只,体重23±2 g,购自山西省肿瘤医院实验动物中心。适应性喂养1周后,随机分为4组。实验期间小鼠喂食山西医科大学提供的专用全价大颗粒饲料,自由摄食与饮水。对照组小鼠饮用蒸馏水,砷染毒组饮用含10 mg/L As的亚砷酸钠水溶液,连续60 d。杂粮早餐粉干预组在饮用10 mg/L As水的同时灌胃7.15%或14.3%的早餐粉冲剂,灌胃剂量参照文献略作改动[11],每3天1次。动物室温度24±2℃,相对湿度40%～60%,自然采光。

染毒期间观察小鼠整体状况,记录饮水量,测量小鼠体重。

1.3 实验动物解剖与取材

禁食12 h后,质量百分比为1%的戊巴比妥钠麻醉,称重,迅速打开腹腔取出肝脏,冷生理盐水浸洗,滤纸吸干表面浮水,称肝脏重。取部分肝脏用质量百分比为4%中性甲醛固定,其余肝脏组织经液氮冷冻后-80℃保存备用。

1.4 小鼠肝脏抗氧化指标检测

取冻存的肝组织,加入冷生理盐水,制成10%(质量百分比)的组织匀浆,3 000 r/min低温离心10 min,取上清液检测其中氧化应激指标。超氧化物歧化酶(SOD)活性,还原型谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量采用南京建成生物科技有限公司试剂盒检测;谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性采用DTNB直接法测定;谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性采用CDNB比色法;蛋白含量测定用考马斯亮蓝比色法。

1.5 组织切片制备

取甲醛固定24 h的肝组织,制备石蜡切片。肝组织用乙醇溶液进行梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切成4～5 μm厚的切片。苏木素-伊红(HE)染色,光学显微镜观察。

1.6 数据分析

采用SPASS 19.0软件对数据进行统计分析。结果以均值±标准误表示。采用Duncan方法进行多重比较,分析不同处理组间的差异显著性。图中用相同小写字母表示差异不显著,不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 小鼠一般情况及肝脏脏器系数

在整个实验期间,实验动物未出现死亡。小鼠的行走、饮食正常。根据小鼠饮水量计算砷摄入量,As组和As+早餐粉组小鼠每天平均摄入As的量为1.731 mg/kg体重。各组肝脏脏器系数无明显差异(P>0.05)。

2.2 肝脏组织的氧化应激与氧化损伤

饮用含10 mg/L As的水60 d后,小鼠肝脏组织中抗氧化酶SOD、GSH-Px和GST的活性显著下降,抗氧化小分子GSH含量下降,H2O2和MDA含量显著增高(P<0.05)(图1),表明砷染毒组小鼠肝脏组织发生了氧化胁迫和氧化损伤效应。

摄入As的同时灌胃杂粮早餐粉,小鼠肝脏组织中GSH和H2O2含量与As组无显著差异(P>0.05),SOD、GSH-Px和GST活性显著高于As组(P<0.05),与对照组水平接近,MDA含量显著低于As组(P<0.05)。结果表明,摄入一定量的杂粮早餐粉能提高动物肝组织抗氧化能力,降低As对小鼠肝脏的氧化胁迫,减缓As暴露所致小鼠肝脏组织的氧化损伤。

注:A:对照;B:As;C:As+7.15%早餐粉;D: As+14.3%早餐粉图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著Fig.1 Arsenite-induced oxidative stress in mouse livers and related antagonistic effects of grain breakfast图1 砷对小鼠肝脏组织的氧化胁迫及早餐粉干预效应

2.3 肝脏组织切片观察

肝脏组织HE染色后观察发现,对照组小鼠肝小叶结构正常,肝细胞形态正常,肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射状排列,无炎性细胞浸润(图2)。As组小鼠肝细胞排列紊乱,肝索结构不清,明显的炎性细胞浸润,肝细胞水肿,肝窦扩张充血。与As组相比,As+7.15%早餐粉组肝小叶结构的边界变得较清楚,肝组织损伤减轻,As+14.3%早餐粉组肝组织炎性细胞浸润现象减少,肝小叶基本恢复正常,肝索走向正常。

3 讨论

已有研究表明,As对机体的损伤与其引发组织氧化胁迫和氧化损伤有关[6,8-9,12]。机体氧化应激状态与多种疾病的发生有关。本研究中,通过饮用含As水诱发了实验小鼠肝脏组织的氧化胁迫和结构损伤,符合现有研究关于As毒性与氧化胁迫关联的描述,说明本条件下肝脏的损伤与氧化胁迫存在一定的关系。采用具有较强体外抗氧化能力的杂粮早餐粉灌胃,降低了As暴露造成的肝脏毒性效应,同期氧化胁迫指标改变,说明降低氧化胁迫可以减轻As的肝脏毒性。

脏器系数是反应某个脏器受损的有效和灵敏的指标,可反映一种化学物质对其的综合毒性作用。研究报道,雄性C57BL/6小鼠饮用含5 mg/L或50 mg/L As的水溶液180 d后,肝脏脏器系数显著升高[13]。本研究小鼠饮用含10 mg/L As的水60 d后,As暴露组肝脏脏器系数未见明显变化,经不同剂量的杂粮早餐粉干预后肝脏脏器系数也未见显著性差异,与上述文献结果不一致,可能与小鼠品系、暴露时间等不同有关。

As在肝脏中进行甲基化代谢的过程中产生大量ROS,并消耗胞内还原型GSH和硫氧还原蛋白,引发组织的氧化应激和氧化损伤[7]。本研究中小鼠通过饮水摄入As后肝脏GSH含量、SOD、GSH-Px和GST活性下降,H2O2和MDA的含量显著增高,这与以往的动物实验结果一致[3,14-15],说明As暴露会使内源性抗氧化酶活性抑制,抗氧化物质消耗增大,机体清除自由基的能力降低,导致膜脂过氧化产物MDA水平升高,肝脏组织氧化损伤。As与巯基(—SH)有极高的亲和力,与含—SH的酶、功能蛋白及小分子结合,使含巯基的抗氧化酶活性及抗氧化物质活性被抑制,可导致细胞内ROS累积,促进细胞氧化应激[15]。由于GSH是机体内重要的抗氧化物质,可直接清除自由基,在毒物解毒过程中发挥重要作用;GSH-Px是机体重要的含巯基抗氧化酶,以GSH为底物催化过氧化物的分解;GST能够代谢小分子的氢过氧化物,保护细胞免受ROS的损害。SOD是机体内关键的抗氧化酶,它可以高效地清除生物氧化产生的超氧阴离子,使之转化为H2O2,然后H2O2被酶分解产生O2和H2O。因此,As暴露期间肝脏组织抗氧化酶活性和抗氧化分子含量的降低,导致了肝脏组织的损伤。

采用杂粮早餐粉干预降低了As暴露引发的实验动物肝脏氧化损伤,可能与杂粮早餐粉含有丰富的蛋白质、氨基酸、花色苷、多酚类和维生素等均衡营养成分有关。杂粮早餐粉主要成分之一的小米含有多酚类物质,是主要的抗氧化活性成分[16],其中的大量酚羟基,极易被氧化,且可作为氢供体,将活性态氧自由基还原成活性比较弱的三线态氧,从而减少氧自由基的产生。多酚类物质可通过信号转导途径调控转录因子活性和机体抗氧化酶基因表达,进一步增强机体抗氧化系统的氧化应激能力,发挥其抗氧化作用[17];黄豆中的色氨酸和酪氨酸作为氢供体与自由基结合形成中间体,可阻断自由基所致的链式反应,有效防止As引起的氧化应激[18];同时杂粮早餐粉中的α-亚麻酸可上调SOD基因的表达水平,提高SOD活性[19]。因此,杂粮早餐粉提供的均衡营养成分能够提高肝脏组织酶和非酶抗氧化剂的水平,阻止自由基链式反应,增强肝脏组织的抗氧化能力。本研究将黄豆高含量的赖氨酸与小米中低含量的赖氨酸混合食用,起到氨基酸互补作用,提高了复配式粗杂粮蛋白质的营养价值。与使用外源性抗氧化剂VC 、VE降低As毒性[9]相比,本研究采用的杂粮早餐粉在增强抗氧化功能的同时提供了人体所需的均衡营养成分,在食用营养早餐的同时可补充丰富的抗氧化成分,是一种有效干预As毒性的餐食。作为即食型早餐粉,杂粮早餐粉的使用将为高As饮用水地区的居民提供一种预防慢性As毒性的方便途径。

本文通过饮用含As水诱发了实验小鼠肝脏组织的氧化胁迫和氧化损伤,杂粮早餐粉能通过增强小鼠的抗氧化能力,缓解As摄入对肝脏组织的氧化胁迫,减轻肝组织的病变程度,说明杂粮早餐粉对预防As毒性有一定的功效。