化瘀消癥颗粒对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8／SVneo 侵袭迁移的影响

孙建华郜 洁刘开飞王焱皙李丽芳 邓高丕∗

（1.广州中医药大学第一临床医学院，岭南医学研究中心，广东 广州510405；2.广州中医药大学第一附属医院妇儿中心，广东 广州510405；3.南方医科大学药学院，广东 广州510515；4.宁夏回族自治区中医医院暨中医研究院，宁夏 银川750021）

异位妊娠是指受精卵在子宫体腔以外着床［1］，发生率约为2%［2］。因输卵管妊娠破裂导致的死亡占所有妊娠相关疾病死亡的2.7%，是出血性疾病死亡的首要因素［3］。输卵管是异位妊娠最常见的种植部位，90%以上的异位妊娠发生在输卵管［1］。西医对输卵管妊娠的管理包括手术治疗、药物治疗和期待疗法［4］。手术治疗可造成生育功能破坏、输卵管或盆腔组织粘连等，同时经济花费较高［5］。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）作为输卵管妊娠治疗的一线药物［5］，可导致恶心、呕吐、骨髓抑制、甚至死亡等严重的并发症［4］。期待疗法的成功率则非常依赖于病例选择［4］。中药保守治疗符合用药标准的输卵管妊娠，往往能取得良好的临床疗效，同时保留了患者的生育功能。化瘀消癥颗粒用于辅助治疗早期输卵管妊娠少腹血瘀证，是课题组总结、整理、优化开发的广州中医药大学第一附属医院院内制剂。滋养细胞的侵袭迁移是输卵管妊娠进展和最终导致输卵管破裂的重要因素［6］。Integrin β3／FAK 通路为介导滋养细胞浸润迁移的重要通路，本研究从该通路出发，探讨化瘀消癥颗粒的杀胚机制，为后续临床应用和深入基础研究提供依据。

1 材料

1.1 试药 化瘀消癥颗粒由丹参、赤芍、桃仁、紫草、天花粉组成，为广州中医药大学第一附属医院院内制剂（粤药制字Z20170001），由广州中医药大学药学院制备，经水提过滤、减压浓缩，最终制备为冻干粉。用RPMI-1640将其配制成20 g ／L 储存液，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，分装冻存于-20 ℃冰箱，实验时根据需要稀释至所需浓度。

1.2 细胞株 人绒毛膜滋养层细胞HTR-8／SVneo 购买于美国ATCC 细胞库，细胞培养于广州中医药大学岭南医学研究中心。

1.3 试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25% 胰酶、双抗（青霉素-链霉素）（美国Gibco 公司）；PBS（美国Hyclone 公司）；CCK8试剂盒（日本同仁公司）；结晶紫染色液、RIPA（强）裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；4%多聚甲醛（北京雷根生物技术有限公司）；Matrigel Matrix 基质胶、Transwell 小室（美国BD 公 司）；integrin β3、E-cadherin、p-FAK、Src、p-Src、GAPDH 美国CST 公司），黏着斑激酶（FAK 美国Abcam 公司）；二抗（北京普洛麦格生物技术有限公司）；ECL 化学发光液（美国Bio-rad 公司）；RNA 提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司）；逆转录试剂盒（RevertAid First Strand Cdna Synthesis Kit）、qPCR 试剂 盒（Maxima SYBR Green qPCR Master Mix）（美国Thermo 公司）；PCR引物设计及合成（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.4 仪器 CO2培养箱（上海三腾仪器有限公司）；荧光倒置显微镜（日本Nikon 公司），常温离心机、高速冷冻离心机（美国Thermo 公司）；生物安全柜（上海力康生物医疗科技控股有限公司）；细胞计数仪（美国Nexcelom 公司）；超微量分光光度计（德国Lmplen 公司）；逆转录合成仪、凝胶成像系统、实时荧光定量核酸扩增仪、电泳仪及转膜仪（美国Bio-rad 公司）。

2 方法

2.1 细胞培养 采用8%的FBS（含1%双抗）在5% CO2细胞培养箱中进行细胞培养。当细胞融合至90%进行细胞传代或种板，具体方法如下：吸弃原培养液，用PBS 轻轻漂洗细胞，吸弃PBS 加入适量0.25% 的胰酶，37 ℃消化2 min，加入8%的FBS 终止消化，轻轻吹打细胞使其悬浮，收集细胞悬液至15 mL 离心管进行离心（500 r／min，5 min），弃上清用8% FBS 重悬细胞，混匀后进行细胞计数，采用合适的细胞密度进行传代或中板。

2.2 CCK8检测HTR-8／SVneo 细胞增殖 取对数生长期的细胞消化计数后接种至96孔板（1×104／孔），每孔100 μL，贴壁24 h 进行加药干预。实验设置不同浓度化瘀消癥颗粒组（0.125、0.25、0.5、1、2 g／L）、阳性对照组（0.08 ng／L甲氨蝶呤）、对照组，分别培养12、24、48 h，每组设5个复孔。培养结束后，每孔加入10 μL CCK8继续培养4 h，用酶标仪于450 nm 波长处测吸光度，实验重复3次。细胞存活率=［（OD实验组-OD空白组）／（OD对照组-OD空白组）］×100%。

2.3 划痕实验检测细胞迁移 将6孔板底部水平画线，取对数生长期的细胞消化计数后接种至板上（4×105／孔），每孔2 mL。分组为化瘀消癥颗粒组（0.5 g／L）、对照组、阳性对照组。化瘀消癥颗粒浓度由CCK8实验确定，化瘀消癥颗干预细胞48 h 半数抑制浓度（IC50）对应的中药浓度。细胞融合约至90%，用200 μL 枪头垂直用力划痕，PBS 漂洗，按分组加入设定浓度的药物溶液并拍照。24 h后再次拍照观察各组细胞迁移距离。

2.4 Transwell 实验检测细胞侵袭 将matrigel 基质胶放于4 ℃过夜，用RPMI 1640培养液以1 ∶8稀释基质胶，取80 μL 平铺于Transwell 小室中，37 ℃孵育过夜，使胶凝固。种板前用RPMI 1640培养液水化30 min。采用取对数生长期的细胞消化计数后接种至Transwell 小室（2×104个／孔），每孔200 μL（1% FBS）。分组为化瘀消癥颗粒高、中、低剂量组（0.5、0.4、0.3 g／L）、对照组、阳性对照组。下室每孔加750 μL 10%的FBS，37 ℃培养24 h。吸弃培养基，用4% 多聚甲醛固定15 min，甲醇透化5 min，0.1%结晶紫蓝染色15 mim。显微镜下观察各组细胞穿过小室基质胶的情况，并拍照计数。实验重复3次。

2.5 qRT-PCR 检测细胞相关基因表达 分组及干预同2.4项，采用Mazol 法提取细胞总RNA，进行浓度和纯度测定，根据逆转录试剂盒提供的实验步骤进行逆转录和PCR 反应。PCR 引物序列为E-cadherin引物，正向5’ -GAAAACAGCAAAGGGCTTGGA-3’，反向5′-TGGGGGCTTCATTCACATCC-3′；integrin β3引 物，正 向5′-TTGGAGACACGGTGAGCTTC-3′，反 向 5′-TTAGGTTCAGCTTGGGCCTG-3′。PCR 反应条件为95 ℃，1 0 min。95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃10 s；共40个循环。在65～95 ℃之间每0.5 ℃为升温单位采集绘制溶解曲线。每组设3个复孔，实验重复3次。采用2—△△Ct值计算目的基因表达量。

2.6 Western blot 检测细胞相关蛋白表达 分组及干预同2.4项，干预24 h 后用RIPA 裂解细胞，提取各组细胞总蛋白，进行蛋白浓度后加入loading buffer 进行煮沸变性。上样，电泳，湿转法转膜，用5%脱脂奶粉封闭1～2 h 后敷相应一抗（目的蛋白抗体1 ∶500～1 ∶1 000，GAPDH 1 ∶2 000），4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜；加入二抗（1 ∶2 000）室温孵育1 h，TBST 洗膜；ECL 化学发光后经凝胶成像仪显影；Image J 软件分析蛋白条带灰度值。采用目的蛋白条带灰度值／GAPDH 或磷酸化蛋白／总蛋白条带灰度值计算目的蛋白相对表达量。

2.7 统计学分析 通过SPSS 20.0及graphpad prism 6.0进行处理，计量资料采用（）表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐采用LSD 进行两两比较，方差不齐者采用Dunnett’s T3检。P＜0.05为有统计学差异。

3 结果

3.1 化瘀消癥颗粒对HTR-8／SVneo 细胞增殖的影响 化瘀消癥颗粒对HTR-8／SVneo 细胞活性的抑制作用呈时间和浓度依赖性。见图1。

图1 化瘀消癥颗粒对HTR-8／SVneo 细胞增殖的影响（n=3）

3.2 化瘀消癥颗粒对HTR-8／SVneo 细胞迁移的影响 化瘀消癥颗粒、甲氨蝶呤干预HTR-8／SVneo 细胞24 h 后，对照组HTR-8／SVneo 细胞向划痕处迁移，化瘀消癥颗粒组划痕面积较对照组变化较小。见图2。

3.3 化瘀消癥颗粒对HTR-8／SVneo 细胞侵袭的影响 化瘀消癥颗粒、MTX 干预HTR-8／SVneo 细胞24 h 后，与对照组比较，化瘀消癥颗粒（0.4、0.5 g／L）可显著抑制体外HTR-8／SVneo 细胞侵袭能力（P＜0.01），并呈浓度依赖性。与阳性对照组比较，化瘀消癥颗粒0.5 g／L 组侵袭细胞数减少（P＜0.01）。见图3。

图2 化瘀消癥颗粒对HTR-8／SVneo 细胞迁移的影响

图3 化瘀消癥颗粒对HTR-8／SVneo 细胞侵袭能力的影响（n=3）

3.4 化瘀消癥颗粒对HTR-8／SVneo 细胞integrin β3、EcadherinmRNA 表达的影响 与对照组比较，化瘀消癥颗粒（0.3、0.4、0.5 g／L）明显下调integrin β3 mRNA 表达，上调E-cadherinmRNA 表达（P＜0.05）。见图4。

图4 化瘀消癥颗粒对HTR-8／SVneo 细胞integrin β3、 E-cadherin mRNA 表达的影响（n=3）

3.5 化瘀消癥颗粒对HTR-8／SVneo 细胞integrinβ3、p-FAK、p-Src、E-cadherin 蛋白表达的影响 与对照组比较，化瘀消癥颗粒（0.4、0.5 g／L）E-cadherin 蛋白表达上调（P＜0.05，P＜0.01），integrinβ3及p-FAK 蛋白表达下调（P＜0.05）；化瘀消癥颗粒（0.3、0.4、0.5 g／L）p-Src 蛋白表达下调（P＜0.01）。见图5。

4 讨论

图5 化瘀消癥颗粒对HTR-8／SVneo 细胞E-cadherin、integrin β3、p-FAK、p-Src 蛋白表达的影响（n=3）

在早期胚胎种植过程中，从胎盘滋养细胞（cytotrophoblast，CTB）到绒毛外滋养细胞（extra-villous trophoblast，EVT）转化是胎盘植入的基本过程，细胞滋养细胞的侵袭过程类似于肿瘤细胞［7］。绒毛细胞滋养细胞黏附于子宫后，部分间质化形成EVT，从而获得了侵袭迁移的能力，使得EVT 穿过子宫上皮细胞基底膜并向间质及其动脉浸润［7-8］。细胞滋养细胞黏附于子宫后的生理过程涉及对基底膜或细胞外基质成分的附着、降解，并在被降解成分中迁移。在输卵管妊娠中，EVT 侵袭和继而发生的胎盘形成和正常宫内妊娠有很多相似性［9-10］。

整合素属于黏附分子家族，是由α 和β 亚基靠非共价键连接而成的异二聚体跨膜糖蛋白，介导细胞与细胞、基质与细胞间的黏附［11］。Integrinβ3和细胞外基质分子结合可以激活包括侵袭、迁移、增殖、存活等在内的各种通路［11-12］。研究表明，Integrinβ3表达缺陷可以削弱滋养细胞的侵袭和迁移能力，使滋养细胞浸润不足，从而促使先兆子痫形成［13］。黏着斑激酶是胞内信号蛋白非受体酪氨酸激酶，位于整合素富集的黏着斑处，与细胞黏附和迁移密切相关［14-15］。FAK 有6个酪氨酸磷酸化位点，其中Tyr397位点是自磷酸化位点，其激活才能使FAK 结合原癌基因Src的位点暴露并与之结合从而使FAK 完全磷酸化，活化的FAK 和Src 复合物通过作用于其他蛋白激活下游信号通路，从而调节细胞不同的功能［15］。既往研究发现，整合素／FAK 信号通路在细胞的侵袭迁移过程中发挥着重要作用［16］，FAK／src 信号通路亦和滋养细胞的侵袭迁移密切相关，抑制FAK／Src 信号通路可以明显减弱滋养细胞的侵袭迁移作用，从而影响早孕 胚胎种植［17］。黏附分子Ecadherin 是参与上皮间质化及侵袭迁移的重要蛋白［18］，有研究对孕早期胎盘中CTB 和EVT 进行配对，并用PCR 探针比较相关基因的表达，结果表明在EVT 中E-cadherin 表达是下调的［18］，侧面反映其低表达水平可促进滋养细胞侵袭和迁移。

化瘀消癥颗粒中丹参、桃仁、赤芍、活血祛瘀止痛，并具有抗肿瘤之功［19-22］。紫草凉血活血，可抑制小鼠早期胚胎发育［23］。天花粉同具抑制肿瘤和抗生育之效［24-25］。本研究从侵袭迁移的角度，进一步探讨化瘀消癥颗粒的作用机制。

课题组前期对体外培养的输卵管妊娠滋养细胞与正常宫内早孕滋养细胞进行比较，结果发现二者增值能力、生长周期、外观形态及侵袭能力相似［26-27］，故本研究选用人绒毛膜滋养层细胞HTR-8／SVneo 细胞为载体细胞进行化瘀消癥颗粒作用机制探索。

本实验采用划痕实验检测高、中、低剂量的化瘀消癥颗粒对滋养细胞迁移能力的影响，结果提示和阴性对照组相比，化瘀消癥颗粒组及阳性对照MTX 组中滋养细胞迁移距离均减小。Transwell 实验表明高、中、低剂量的化瘀消癥颗粒均可抑制HTR-8／SVneo 细胞侵袭，并呈剂量依赖型，高剂量组抑制作用优于阳性对照组。qRT-PCR 和Western blot 结果表明，化瘀消癥颗粒可以提高E-cadherin mRNA 和蛋白表达，降低integrin β3 mRNA 和蛋白表达及FAK、Src 的磷酸化水平。本研究提示化瘀消癥颗粒可能通过抑制integrin β3／FAK 信号通路抑制滋养细胞侵袭迁移。

综上所述，化瘀消癥颗粒能抑制HTR-8／SVneo 细胞侵袭和迁移，其杀胚机制可能和调节整合素β3／FAK／Src 信号通路有关。