MAPK和NO相关信号通路在电针镇痛作用机理的研究进展*

杜 宁 李 娴 樊碧发 邵 蕊

（1河北省唐山市第二医院麻醉科，唐山 063000；2卫生部中日医院疼痛科，北京 100029；3华北理工大学中医学院, 唐山 063000）

世界卫生组织 (World Health Organization,WHO)列出针刺可用于40余种疾病的治疗，疼痛属其中之一[1]。针刺可靠的镇痛作用已经得到广泛的认同和应用。电针镇痛，是指首先通过毫针刺入腧穴后，再用电针仪通过毫针输入电流而达到镇痛目的。电针镇痛的相关机理，以往研究发现多与以下几方面有关：①神经通路的调节[2,3]；②对神经化学机制的调节[4]；③对于体内镇痛物质分泌的调节[5～7]等。而近年来，对于针刺镇痛作用机制的研究，已经到了细胞、分子水平乃至基因蛋白水平。本文则对于近年来与电针镇痛作用相关的细胞信号转导通路研究进展进行总结。

本文选择MAPK （其中包括P38 MAPK、JNK、ERK信号通路） 和海马NO-cGMP-PKG信号通路为例，主要原因为目前针刺镇痛相关信号转导通路研究较少，而这两条通路研究相对较多，所以以这两条信号通路为例进行论述。

一、基于丝裂原活化蛋白激酶MAPK (mitogen-activated protein kinase) 信号通路[8]的针刺镇痛作用机制研究

MAPKs广泛地分布在细胞内的一种蛋白激酶，不仅参与细胞的生长、发育、分裂分化，而且介导外周及中枢神经，参与痛敏的形成[9]。其家族成员包括ERK （胞外信号调节蛋白激酶） 、P38 MAPK、JNK/SAPK和ERK5。其家族成员将细胞外刺激通过转录的方式转变为细胞内反应[10]。

MAPK信号通路参与基因表达调控，细胞增殖和凋亡等生理反应，且发现其在神经元可塑性调节方面发挥重要作用。病理状态下外周伤害性信号通过传入神经元传入脊髓背角，引起兴奋性氨基酸和SP表达增多，导致伤害性神经元胞膜发生持续性去极化，Ca2+大量内流。内流的Ca2+激活细胞内的Ca2+依赖性蛋白激酶，比如CaMK, PKA和PKC等。细胞内大量的信号转导通路发生改变最后都汇集于MAPK信号通路。MAPK信号通路能够激活cAMP反应元件结合蛋白 (cAMP response element binding protein, CREB)，引起基因的表达发生改变，最终导致神经元的功能改变。

1.P38 MAPK信号通路

MAPK信号转导通路错综复杂，有多条通路并行。P38 MAPK信号转导通路是其中一条。细胞内具有高度保守性[11]的三肽模体“T-G-Y”结构—P38 MAPK，是一条经典细胞通路，不仅参与细胞炎症反应、细胞凋亡反应，而且对于疼痛信息的传导也是一条非常重要的通路[12]。当外界环境受到刺激时，如物理化学因素或炎性因子等，蛋白激酶级联反应刺激该通路发生磷酸化，进而引起一系列细胞反应[13]。

P38 MAPK细胞通路对于痛觉过敏的炎性疾病的研究中具有重要的研究价值[14]。其调节疼痛的机制是通过TRPV1、CGRP、SP而发挥作用，该通路对于疼痛的调节不仅包括外周敏化还包括中枢敏化。P38 MAPK通过调节多种疼痛介质参与中枢敏化的调节，疼痛介质如：BDNF、IL -1β、COX-2、TNF-α 等。

P38主要分布在SDH和胶质细胞[15]，电针可直接抑制P38磷酸化[16]，又可通过抑制P38及其下游信 号ATF/CREB 抑制 TRPV1、TNF-α、1L-1β和COX-2表达，从而抑制炎性疼痛[17]。另外，在CFA诱导的炎性疼痛中，p38不仅在SDH，而且在中脑导水管周围灰质(PAG)和延髓头端腹内侧核（RVM）均有表达，提示p38介导了疼痛调制下行通路兴奋。

动物实验研究中，电针治疗组有效提高疼痛模型组大鼠的痛阈，电针可以抑制该通路的磷酸化，从而提高大鼠的痛阈值[18,19]。研究者研究远近配穴针刺对自体髓核移植腰痛大鼠机械缩爪阈和脊髓中p38丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)及环磷酸腺普(CAMP)表达的影响中发现远部取穴、近部取穴和远近配伍取穴电针均能对内源性髓核刺激导致的腰痛模型大鼠7d内痛阈和脊髓P38 MAPK、cAMP（除远穴组外）表达产生调节作用，同时发现远近配穴电针使得髓核源性神经病理性痛大鼠痛自术后3a起逐渐升高，发挥了针刺镇痛效应。这一效应与其调节脊髓中P38 MAPK和cAMP的表达结果基本一致[20]。电针可以通过调节慢性痛中胶质细胞膜受体、细胞因子、神经营养因子、细胞内信号通路的活动，抑制胶质细胞的激活起到镇痛作用[21]。有报道，在慢性神经痛模型中，电针减轻疼痛的同时，可抑制脊髓背角I-II板层星形胶质细胞TNF-β mRNA和IL-1β mRNA表达，激活脊髓背角和背根节的生长抑素（非阿片神经肤）和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)及其受体家族(GFR) β-1系统[22]，显著上调脊髓轴突导向因子Eph-B3蛋白和基因及Eph-Bl基因表达[23]，下调脊髓OX-42/GFAP/基质金属蛋白 (MMP)-9 /MMP-2/ TNF- α/IL-1 β的活性。在慢性炎症痛模型中，电针可以激活脊髓内源性孤啡肤受体系统，下调脊髓磷酸化P38 MAPK/ATF-2 /VR-1通路，抑制脊髓背角SP/NK-1受体表达和腰段脊髓背角(I-IV板层)c-fos标记的神经元异常活动。

临床电针分娩镇痛的研究中，其是一种安全有效、操作简单、对母婴无创伤的非药物治疗方法。在针刺镇痛领域，MAPKs是较为重要的研究对象，P38 MAPK信号通路可被应激刺激激活，对疼痛发生、发展起着重要的作用。P38 MAPK与分娩镇痛的关系，从基因水平及细胞分子学水平为电针分娩镇痛提供科学依据[24]。

研究发现，P38 MAPK可以激活一些致痛因子，还能通过调节基因转录和蛋白翻译在疼痛的发生与维持中发挥作用。大鼠后肢足底注射辣椒素，会激活大鼠注射周围组织和脊髓P38 MAPK，腹腔、皮下和鞘内注射P38 MAPK抑制剂 (SD-282) 能减轻试验动物的痛觉过敏，提示外周和脊髓的P38 MAPK都参与辣椒素诱导的热痛觉过敏调节。Jin等通过脊神经结扎(spinal nerve ligation, SNL)模型研究神经病理性疼痛发现损伤侧脊髓背角小胶质细胞中的P38 MAPK磷酸化阳性蛋白明显增多，持续时间超过3周，提示脊髓小胶质细胞中的p38MAPK激活对神经病理痛的发生和维持有重要意义。背根神经节和脊髓小胶质细胞中P38 MAPK的表达后期时间上表现出重叠性，提示二者在神经病理性疼痛的后期都有重要意义。COX2 （环氧化酶-2）， iNOS（诱导型一氧化氮合酶）和多种细胞因子都在小胶质细胞中表达，P38 MAPK可能就是通过这些神经递质或者调制在转录和翻译水平上参与疼痛调节。深入研究P38 MAPK在疼痛敏化中的作用机制，可以为疼痛性疾病提供新的治疗靶点。

2.JNK（c-Jun氨基末端激酶）信号通路

JNK通过激活MAPK激酶激酶/ MAPK 激酶/MAPK 的 途径实现[25]。TAK1(TGF-β-activated kinase c-TAK1)作为MAPKKK成员之一，是外周神经损伤后诱导机械痛觉过敏产生的必要因素[26]。

c-jun是即刻早期基因 (immediate early genes,IEGs) 家族中的成员，细胞在受到各种刺激（如神经损伤），尤其是细胞因子的刺激时，可激活细胞内第二信使如cAMP，引起相应节段神经元c-jun表达，使位于细胞中的c-jun, c-Fos蛋白的丝氨酸和苏氨酸磷酸化，形成异源二聚体jun/fos或同源二聚体jun/jun。JNK不但能使c-Jun磷酸化还可增加其转录活性，主要以c-Jun为底物并提高激活蛋白-1(AP-1) 的转录活性，其他底物包括激活转录因子-2(ATF-2) ，Ets样转录因子-1 (Elk-1)、人类抑癌基因p53和活化T细胞核因子 (NFAT4)等。

JNK在慢性疼痛的发生和发展过程中发挥了重要作用。通过对大鼠进行造模形成坐骨神经损伤大鼠模型，电针针刺环跳穴，分为深刺组及浅刺组，观察不同组对于大鼠L4-L5脊髓c-jun磷酸化的蛋白表达，结果针刺对脊髓p-JNK和p-c-jun表达水平均有下调，对于JNK信号通路有一定的抑制作用[27]。电针可通过降低JNK1/2及下游的c-jun基因来降低COX-2。

3.ERK信号通路（见图1）

ERK通路的经典传递途径是：Ras-Raf-MEKERK途径，在痛觉信息传递中具有重要的作用[28]。

对于该通路的相关针刺镇痛机理的研究，主要是躯体的炎性痛和神经病理性疼痛。通过对CFA致炎性痛大鼠ERK1/2磷酸化水平的影响，观察p-ERK1/2阳性细胞的表达情况，结果表明，电针治疗组p-ERK1/2阳性细胞明显降低，电针发挥镇痛作用与ERK信号通路有关[29]。

脊髓ERK活化可促进中枢敏化。电针通过抑制ERK1/2及其下游的CREB降低环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)和神经激肽1，从而抑制CFA诱导的炎性疼痛[30]。PI3K作为第二信使，通过作用于其下游的PKA以及ERK通路介导多种细胞信号级联反应，在炎性疼痛中发挥一定作用[31]。

研究显示[32]电针颈夹脊穴对神经根型颈椎病CSR (cervical spondylotic radiculopathy)大鼠具有明显的镇痛作用，通过 ERK信号通路调节神经细胞自噬，抑制神经细胞凋亡以修复损伤神经根可能是实现其镇痛作用的重要机制。电针分娩镇痛的研究中发现电针能有效降低大鼠脊髓ERK通路信号分子 Raf (Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)、ERK 、CREB (cAMP-response element binding protein) 蛋白与基因表达及提高靶器官子宫肌层组织DYN蛋白与基因表达，可能就是电针镇痛的作用机制之一。

图1 ERK信号转导通路[8]

观察电针华佗夹脊穴对佐剂性关节炎大鼠脊髓背角内磷酸化ERK表达的影响，从信号转导的角度研究电针镇痛可能的作用机制。研究表明，完全福氏佐剂致炎症痛大鼠痛阈明显降低，脊髓背角内p-ERK表达明显增加，经过电针夹脊穴治疗后，治疗组大鼠与模型组大鼠相比痛阂明显提高，对伤害性机械性刺激的疼痛敏感性下降，同时脊髓背角内p-ERK表达明显减少，表明ERK磷酸化增加在疼痛发生以及电针夹脊穴镇痛过程中也同样起着重要作用。电针可能通过调节佐剂性关节炎大鼠脊髓背角内p-ERK表达水平从而发挥镇痛效果。电针华佗夹脊穴可明显缓解佐剂性关节炎大鼠炎性痛，提高痛阈，而ERK可能为电针镇痛中一个重要的信号转导分子，其磷酸化在炎症痛敏及电针镇痛过程中起重要作用[33]。

4.ERK5信号通路

目前发现ERK5上游信号分子为MEK5，与ERK5的作用具有高度特异性。已有研究表明病理性疼痛下ERK5信号通路被激活[34]。ERK5信号转导通路被激活后，对其转录因子CREB继续激活，进而将疼痛信号在大脑脑脊液接触核进行传导[35]，肖纯等[36]从背根神经节角度研究也得出相同的结论。目前有关 ERK5 信号通路在疼痛领域的研究相对较少，而从针刺镇痛角度研究的尚未见报道，有待于今后的深入研究。

二、基于海马NO-cGMP-PKG信号通路[37]（见图2）的针刺镇痛作用机制研究

图2 海马NO-cGMP-PKG信号通路传导路径[37]

以往研究表明海马多与记忆、学习有关。但研究发现海马与疼痛感知与调控有密切关系，电针刺激海马后，其颗粒细胞层内的敏感神经细胞使其痛阈升高。NO是一种脂溶性气体分子，在神经元之间弥散进行信息传递，参与痛觉过敏等生理及病理生理过程。

NO参与外周及中枢水平的痛觉调制。免疫组织化学实验发现nNOS, cGMP的分布具有很大的相似性。EAA是伤害性刺激初级传入的重要神经递质，它主要是通过NMDA受体发挥信号传导作用，NMDA受体是传导脊髓伤害刺激的重要受体。当机体受到伤害性刺激后，初级传入释放兴奋性氨基酸 (excitatory aminoacid, EAA)激活脊髓背角神经元的N-甲基-D天冬氨酸 (N-methyl-D-aspartic acid,NMDA) 受体，进而使受体通道开放，促进Ca2+内流。在细胞内，内流的Ca2+与钙调蛋白(CaM)偶联，共同作用于NOS，以分子氧和L-Arg为底物，产生NO。NO就通过扩散而作用于邻近细胞，或者直接作用于其所在细胞，结合到胞浆可溶型sGC血红素模体上，使酶发生变构效应而被激活，进而把GTP转化为cGMP，从而增加cGMP，进一步激活cGMP依赖的PKG，从而使海马伤害感受性神经元兴奋，把伤害性信息进一步传向脑中枢，即脊髓水平的NO通过NO-cGMP-PKG信号通路参与伤害性信息的传递过程。

通过用手术线结扎坐骨神经造成病理性神经痛模型，观察正常组、模型组、电针2 Hz组、电针2 Hz/15 Hz组、电针100 Hz组，慢性压迫性损伤 (chronic constriction injury, CCI) 大鼠痛行为反应变化以及电针对海马神经型一氧化氮合酶 (neuronal Nitric Oxide Synthas, NOS)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, iNOS)、细胞内蛋白激酶G (protein kinase G, PKG) 基因表达的影响，测定足底机械痛阈和热痛阈的变化及荧光定量RTPCR法检测海马组织nNOS、iNOS、PKG基因的表达。与正常组比，电针2 Hz组、2 Hz/15 Hz组、100 Hz组动物的痛阈显著升高。结果表明电针“足三里”-“阳陵泉”穴区能明显升高CCI大鼠的痛阈，该作用可能与其下调海马nNOS、PKG 基因表达水平有关，海马细胞NO／PKG信号通路可能参与电针镇痛的累积效应[38]。以上研究显示海马NO-cGMP-PKG信号通路与针刺镇痛有一定的相关性。

三、小结

MAPKs信号通路及海马NO-cGMP-PKG信号通路参与疼痛的一系列过程，对疼痛的信号转导过程起到重要作用。针刺镇痛在细胞间传导的分子机制非常复杂，若想明确阐明电针镇痛机理，信号通路上相关的基因蛋白表达的深入研究，更有助于阐明针刺镇痛效应的机制。

从已有的研究来看，MAPKs信号通路及海马NO-cGMP-PKG信号通路探讨针刺镇痛机制尚存在诸多不足，如疼痛模式研究较为单一固定，目前主要是躯体炎性痛和神经病理性疼痛，其次研究深度不够，对通路的信号传递研究较少。应拓宽研究领域，深入研究信号通路在疼痛过程中的作用方式。目前针刺镇痛应用于各种急慢性疼痛中[39～42]，针刺镇痛的相关信号转导通路研究较少，本文从以上几个通路概述目前研究现状，以期为疼痛性疾病提供新的治疗靶点。