食用植物油中5种儿茶素类抗氧化剂的检测方法研究

韩焕美，张爱霞，闫荣军，郑新华，陈 晞，何桂华

(济南出入境检验检疫局，济南 250014)

茶多酚，又名抗氧灵、维多酚、防哈灵，是茶叶中多酚类物质的总称，可分为儿茶素类(黄烷醇类)、羟基-[4]-黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等[1-2]，其中以儿茶素类最为重要，占多酚类物质总量的60%～80%。儿茶素类主要包括儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)5种物质[3-6]。研究表明，茶多酚具有较强的抗氧化作用，尤其酯型儿茶素EGCG，其还原性甚至可达L-异抗坏血酸的100倍，4种儿茶素类化合物的抗氧化能力为EGCG>EGC>ECG>EC，且均强于丁基羟基茴香醚(BHA)，5种儿茶素类化合物的抗氧化性能均随温度的升高而增强[7-8]。因此，茶多酚提取物作为天然抗氧化剂在食用油脂中的应用前景广阔。GB 2760—2014明确规定茶多酚的添加量(以儿茶素计)不得超过0.4 g/kg，但是相应的检测方法还不成熟，建立食用植物油中天然抗氧化剂的检测方法，对于食用植物油的质量控制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

橄榄油、大豆油、花生油、调和油，均购于超市。

乙腈、甲醇、正己烷，色谱纯，默克化工技术有限公司；儿茶素(C，CAS 154-23-4，纯度98%)、表儿茶素(EC，CAS 490-46-0，纯度98%)、表没食子儿茶素(EGC，CAS 970-74-1，纯度98%)、表儿茶素没食子酸酯(ECG，CAS 1257-08-5，纯度98%)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，CAS 989-51-5，纯度90%)对照品，南京春秋生物工程有限公司；实验用水均为纯水器制备。

Agilent1260Series液相色谱仪，配有FLD、DAD检测器，美国安捷伦公司；分析天平(感量0.1 mg)，梅特勒-托利多公司；Milli-Q纯水器，美国Millipore公司；IKA-KS130型振荡器，德国IK公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

称取0.010 2 g儿茶素对照品，加入乙腈约2 mL溶解，加入甲醇-水(体积比1∶1)约1 mL促溶，振荡使其完全溶解，再加乙腈稀释至刻度，摇匀得儿茶素标准储备液。

称取表没食子儿茶素对照品0.010 2 g、表儿茶素对照品0.010 2 g、表儿茶素没食子酸酯对照品0.010 2 g、表没食子儿茶素没食子酸酯对照品0.011 1 g，分别置于10 mL容量瓶中，加乙腈适量溶解，再加乙腈稀释至刻度，摇匀得4种儿茶素类化合物的标准储备液。

由标准储备液再配制质量浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 μg/mL的系列混合标准工作溶液。

1.2.2 油脂前处理

精密称取样品约2.000 g，加入10 mL正己烷溶解，然后用10 mL溶剂萃取，振荡约10 s，超声一定时间，6 000 r/min离心10 min，取溶剂萃取层，用萃取溶剂定容至10 mL，过0.45 μm滤膜后进行HPLC分析。

1.2.3 HPLC分析条件

Waters XTerra RP-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A，乙腈；流动相B，甲醇-水(体积比1∶9)；梯度洗脱条件见表1；流速1 mL/min；柱温40℃；进样量10 μL。

表1 HPLC梯度洗脱条件

2 结果与讨论

2.1 检测条件优化

GB/T 8313—2008规定了茶叶中5种儿茶素类化合物的检测方法。在本研究过程中，首先借鉴该标准的检测方法[9]，但由于该方法是检测茶叶中的茶多酚和儿茶素类含量，而本实验是针对食用植物油中可能添加的茶多酚或儿茶素类的检测，基质不同，所以提取方法和具体检测条件不尽相同。

参考GB/T 8313—2008和文献[9]的流动相及洗脱梯度，选择280 nm作为检测波长(油脂前处理条件为萃取溶剂乙腈，超声时间25 min)对油脂中的5种儿茶素类化合物进行检测分析，发现基线平稳、分离度良好，但是响应值偏低。因此，流动相及洗脱梯度基本确定。在此基础上，研究分析了此类化合物的光谱图。光谱数据的采集是HPLC分析过程中同时采集，波长采集区间为210～640 nm。结果表明，5种儿茶素类化合物光谱图十分相似，仅在强度上有细微差别，在280 nm左右有吸收峰，但不是最强的，230 nm左右有吸收肩峰，略强，波长越小，吸收强度越强，因此选择216、230、280 nm作为检测波长，然后择优。图1为5种儿茶素类化合物在3个波长下的液相色谱图。

图1 5种儿茶素类化合物对照品在不同检测波长下的液相色谱图

由图1可见，随着检测波长的蓝移，各吸收峰的强度逐渐变强，分离度不变，基线逐渐复杂，这也不难理解，很多化合物甚至溶剂在短波长下有吸收，这是基线起伏不定的重要原因。因此，在做复杂基质样本的时候最好选择230 nm或280 nm以减少干扰，在本研究过程中，样本选择的是橄榄油，紫外吸收较小，为了提高检测灵敏度，勉强选择216 nm作为检测波长。

2.2 样品前处理条件优化

2.2.1 萃取溶剂的选择

5种儿茶素类化合物均为极性相对较强的化合物，具有脂溶性，也微溶于水，因此本实验在超声时间15 min、萃取次数为2次的条件下，考察了甲醇-水(体积比9∶1)、乙腈-水(体积比9∶1)、乙腈- 体积分数为0.4%的乙酸水(体积比9∶1)、乙腈作为萃取溶剂对5种儿茶素类化合物回收率的影响。结果表明：甲醇-水为萃取溶剂，5种化合物的回收率都不高，在60.4%～71.3%之间；乙腈-水为萃取溶剂，回收率在66.7%～75.6%之间；乙腈- 乙酸水为萃取溶剂，回收率在56.1%～68.6%之间；乙腈为萃取溶剂，回收率在71.2%～80.6%之间。可见，萃取溶剂中减少水或乙酸水这类强水溶性成分，有利于提取油脂中的目标产物，因此先将正己烷和乙腈按体积比1∶1的比例混溶，待静置分层后，可得到饱和正己烷的乙腈，然后按照上述方法提取油脂中的目标产物，5种儿茶素类化合物回收率在82.4%～93.6%之间，满足检测需求。为了提高提取效率和简化提取步骤，采用饱和正己烷的乙腈萃取时，其他条件不变，适当增加振荡次数，取乙腈层后定容至10 mL，然后过滤膜上机检测，发现回收率在79.4%～89.9%之间，并没有显著变化，因此不增加振荡次数，按1.2.2操作即可。

2.2.2 超声时间的选择

超声波可产生高速强力的物理作用，提高溶解效率。因此，依据文献[5]及化合物本身的结构性质，本着简单便捷、减少交叉污染的原则，选择了超声辅助有机溶剂萃取方式。将萃取次数减少为1次，延长超声时间，加标回收率并没有明显降低。因此，在固定萃取次数1次的条件下，对超声时间进行了优化。不同超声时间下，5种儿茶素类化合物的回收率见图2。

图2 超声时间对5种儿茶素类化合物回收率的影响

由图2可见，虽然个别化合物回收率在不同的时间段有明显差异，总体而言，随着超声时间的延长回收率增大，超声时间延长至25 min以后，加标回收率变化不大，因此选择超声时间为25 min。

2.3 5种儿茶素类化合物的标准曲线

按照确定的样品处理方式和检测条件，对5种儿茶素类化合物对照品进行了分析，得到5种儿茶素类化合物的标准曲线回归方程，如表2所示。

表2 5种儿茶素类化合物标准曲线回归方程

2.4 方法验证

为了证实方法的有效性，以橄榄油为空白样本，做了两个梯度的加标回收实验，3个样品的液相色谱图如图3所示。

注：1.加标1.0 μg/mL； 2.加标2.0 μg/mL。

由图3可见，5种化合物吸收峰峰型尖锐，分离度良好，除ECG回收率不是特别良好，其他回收率良好，经计算加标回收率在80%～101.3%之间。这说明，该方法能有效检测橄榄油中5种儿茶素类化合物。为了检验该方法在食用植物油中的通用性、精密度和重复性，实验室借助双梯度多基质加标回收实验，即每种食用植物油样品称取12份样本，每6个为一组，添加5种标准使用液，使得质量浓度为1.0、2.0 μg/mL，然后按照1.2.2操作，检测结果见表3。由表3可见，在各食用植物油中加标回收率均在80%以上，相对标准偏差(RSD)在1.86%～6.45%之间，精密度良好，基本满足检测需要。

表3 5种儿茶素类化合物加标回收率(n=6)

3 结 论

GB 2760—2014中规定茶多酚提取物在食用植物油中添加限量为0.4 g/kg(以儿茶素计)。本文通过优化流动相、检测波长、萃取溶剂、超声时间等，最终建立了5种儿茶素类化合物的检测方法，可有效地检测食用植物油中儿茶素类化合物，经加标回收实验证实，5种儿茶素类化合物分离度好，吸收峰峰型尖锐，加标回收率在80%～101.3%之间，基本满足检测需要。