顶空-气相色谱法测定丁酸梭菌发酵液中短链脂肪酸含量

2019-11-20魏琦麟袁明贵彭新宇康桦华余丹妮徐志宏

中国油脂 2019年10期

魏琦麟，向蓉，袁明贵，彭新宇，康桦华，余丹妮，徐志宏

(1.华中农业大学食品科学技术学院，武汉 430070； 2.广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州 510640)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)在厌氧发酵过程中会产生一系列的短链脂肪酸(SCFAs)，其代谢产物主要为丁酸和丁醇，乙酸和丙酮是副产物，还有少量的乳酸和乙醇产生[1]。丁酸梭菌在肠道内定植后，主要代谢产生乙酸、丁酸和琥珀酸等[2]，90%以上的SCFAs通过质子化和阴离子扩散的方式被肠上皮细胞吸收，只有5%～10%被排泄到体外[3]。SCFAs不仅可以降低肠道pH，抑制有害菌的生长，还可以作为肠上皮细胞能量代谢和生长发育的重要能量来源，维持肠道健康。SCFAs中的丁酸可以作为配体激活特异性G蛋白偶联受体，激活肠黏膜免疫活性，在一定程度上起到增强免疫力的作用[4]。因此，丁酸梭菌发酵过程中的代谢产物及其功能作用受到广泛关注。

生物样品中SCFAs的分析方法较多，如气相色谱法(GC)[5]、高效液相色谱法(HPLC)[6-7]、毛细管电泳法(CE)[8]和离子排斥色谱法(IC)[9]等。Chen等[10]将人体的血液样品经衍生化处理后，通过液相色谱法测定血液中丁酸和己酸含量，虽然该方法可靠性高，但复杂的前处理操作，导致方法的重现性和简便性较差。CE和IC由于仪器设备价格昂贵，成本较高，不具有普遍适用性[11-13]。GC具有灵敏度高，分析时间短，无需衍生化处理等优点，是测定生物样品中SCFAs最常用的方法[14]。样品一般通过有机溶剂萃取后经滤膜过滤，再进行GC分析，然而由于生物样品的复杂性，杂质的存在会污染进样口和毛细管柱，降低分析的准确性，增加维护成本[15]。顶空进样器(Headspace sampler，HS)是一种广泛应用于复杂基质样品中短链物质的分析方法[16-17]，在测定生物样品中的短链成分时具有独特的优势，避免了非挥发性组分对分析造成的干扰，减少了对色谱柱及进样口的污染[18]，在很大程度上弥补了以上方法的缺陷。本文建立了HS-GC分析丁酸梭菌发酵液中SCFAs的方法并进行了方法学验证，以期为生物样品中SCFAs的测定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

丁酸梭菌；乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸和2-乙基丁酸均为色谱纯，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

岛津GC-2010 Plus气相色谱仪，配备氢火焰离子化检测器(FID)；HS-10顶空自动进样器；Rtx-Wax弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

分别精确称取乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸和己酸标准品，纯水定容，配制成200 mmol/L的乙酸、异丁酸、丁酸标准储备液，100 mmol/L的丙酸、戊酸和己酸标准储备液，备用。

分别移取不同体积的标准储备液，配制成混合标准品溶液，其中，乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸和己酸的终浓度均为20 mmol/L。将标准品混合溶液用纯水梯度稀释成不同浓度，在各浓度混合标准品溶液中加入内标物2-乙基丁酸，使内标物浓度均为1 mmol/L。

1.2.2 丁酸梭菌发酵液的制备

将活化后的丁酸梭菌，按3%的接种量接入发酵培养基中，37℃下厌氧培养。每隔2 h取样，样液在5 000 r/min、室温下离心10 min，将上清液与甲酸以100∶1的体积比混合均匀后取1 mL移入顶空进样瓶中，同时加入内标2-乙基丁酸，加盖密封，待测。

1.2.3 HS-GC分析条件

顶空进样器条件：恒温炉温度70℃，样品流路温度90℃，传输线温度110℃；样品瓶加压气压160.0 kPa，样品瓶恒温时间10 min，样品瓶加压时间1 min，GC循环时间22 min。

GC条件：氢气和空气流速分别为60 mL/min和400 mL/min，高纯度氦气流速1.67 mL/min；程序升温为初温80℃，以10℃/min升温至200℃，保持1 min，以20℃/min程序升温至220℃，保持1 min；进样口温度220℃；FID检测器温度300℃，分流比1∶10。

1.2.4 方法学验证

1.2.4.1 标准曲线线性回归方程与检测范围确定

取1.2.1中梯度稀释的标准品溶液，分别进行GC测定。以标准品浓度为横坐标，不同浓度下标准品的峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线，并进行拟合得线性回归方程。

1.2.4.2 日内精密度及日间精密度考察

日内精密度为在同一天内，取同一批分析样品每隔2 h测定1次，每天连续测定6次。日间精密度为同一样品连续3 d进行GC测定分析。通过计算各SCFAs色谱峰的保留时间和峰面积的RSD判断方法的精密度是否符合要求。

1.2.4.3 稳定性考察

将已知浓度的SCFAs混合标准品溶液在4℃下存放，连续3 d取样，在室温下进行GC分析，考察溶液在3 d内的稳定性。

1.2.4.4 样品加标回收率考察

取20 h发酵液样品，测定其中SCFAs浓度后，分别在发酵液中加入低、中、高3个不同浓度的混合标准品溶液，其中低浓度的加入量为样品测定浓度的80%，中浓度的加入量与样品测定浓度相近，高浓度的加入量为样品测定浓度的120%，按下式计算加标回收率。

加标回收率=(加标试样测定值-初始量)/加标量×100%

2 结果与讨论

2.1 标准品色谱图(见图1)

注：1.乙酸；2.丙酸；3.异丁酸；4.丁酸；5.戊酸；6.2-乙基丁酸；7.己酸。

图1 混合标准品溶液色谱图

由图1可见，乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸的保留时间分别为4.840、5.779、6.112、6.800、8.057、9.270 min，内标物2-乙基丁酸的保留时间为8.315 min。各SCFAs峰形良好，基线稳定，拖尾较小，各组分的分离度较好，内标物与其他组分间峰位相近且分离度良好，表明该测定方法可以将待测组分很好地分离，适合SCFAs的分离和鉴定。

2.2 方法学验证

2.2.1 标准曲线回归方程与检测范围

按1.2.4.1方法，得到各SCFAs的标准曲线回归方程，如表1所示。

表1 SCFAs的标准曲线回归方程、检测限、定量限

由表1可见，乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸和己酸在相应浓度范围内标准曲线的线性相关系数均大于0.999，表示在该方法的浓度范围内，各SCFAs标准曲线的线性关系良好。由信噪比法计算得到检出限(LOD)范围为0.01～0.17 mmol/L(S/N>3)，定量限(LOQ)范围为0.02～0.53 mmol/L(S/N>10)。检出限与定量限较低，说明该方法可以作为丁酸梭菌发酵过程中SCFAs含量检测定量方法使用。

2.2.2 日内精密度与日间精密度

按1.2.4.2考察方法的日内精密度和日间精密度，结果分别如表2、表3所示。

表2 日内精密度(n=6)

表3 日间精密度(n=3)

由表2、表3可见，峰面积的日内精密度良好，RSD范围为0.12%～0.93%，3 d内各标准品峰面积的日间RSD为1.18%～2.86%，保留时间的日内RSD和日间RSD分别为0.01%～0.03%和0.07%～0.45%。说明在试验期内，各SCFAs的出峰时间稳定，峰面积变化在误差允许范围内，有较好的日内精密度及日间精密度。

2.2.3 稳定性

按照1.2.4.3方法考察样品的稳定性，结果如图2所示。

图2 标准品稳定性

由图2可见，混合标准品中各SCFAs含量的RSD均在8%以下，表明在该条件下各SCFAs在3 d内具有较好的稳定性，说明在3 d内可使用同一样品进行试验。

2.2.4 加标回收率

按1.2.4.4方法考察样品的加标回收率，结果如表4所示。

由表4可见，乙酸和丁酸的加标回收率范围分别在90.14%～108.71%和88.90%～95.36%之间。表明该方法适用于发酵液样品中乙酸和丁酸的定量测定。

表4 加标回收率

2.3 样品分析

丁酸梭菌在发酵培养基中随时间变化产SCFAs情况如图3和图4所示。

图3 48 h内乙酸含量变化

图4 48 h内丁酸含量变化

由图3、图4可见，应用HS-GC在丁酸梭菌发酵培养基中检测到乙酸和丁酸两种SCFAs。接种后的培养基内含有少量的乙酸，在0～14 h时，乙酸和丁酸的含量变化缓慢，14 h开始，进入到二者含量变化的对数期，乙酸和丁酸的含量增加迅速，尤其是丁酸，在15 h左右含量超过了乙酸，成为发酵液中含量最高的短链脂肪酸，在22 h时进入乙酸和丁酸含量的稳定期，二者含量分别为10.5 mmol/L和12.5 mmol/L左右，持续到32 h，有小幅度的增长，最终丁酸和乙酸的含量分别稳定在14.1 mmol/L和11.9 mmol/L左右。

2.4 讨论

微生物发酵过程中产生的短链物质种类较多，且含量变化各不相同，增加了分析测定的难度。在SCFAs检测过程中，易挥发的性质导致样品定量不准确、重复性差，同时杂质的存在也会影响样品峰形及基线稳定。在相关文献报道中，张小菊等[19]采用同时蒸馏萃取法提取了花生粕混合菌发酵物的短链物质，并使用带有普通进样器的气相色谱仪进行短链物质的测定。结果显示，经过同时蒸馏萃取的短链物质较少，在样品中只检测到少量乙醇，可能的原因是前处理损耗了较多的短链成分，另外蒸馏萃取过程中带有的杂质导致峰形较差并且出峰不明显。吴慧玉[20]使用乙酸乙酯萃取大肠杆菌发酵液中的SCFAs，建立了气相色谱分析方法，各SCFAs之间分离度较好，但由于前处理采用有机溶剂萃取法，在前处理过程中无法避免SCFAs的损失，线性相关系数未能大于0.999，同时由于采用乙酸乙酯作为萃取剂，气相色谱分析过程中会出现较强的溶剂峰，在干扰色谱分析准确性的同时，也产生一定的基质效应。本研究中使用的顶空-气相色谱分析简化了前处理过程，减少了样品中SCFAs在前处理过程中的损失，最大程度地保留了原始组分，检测结果更加接近样品中的真实成分，相比于普通进样分析准确度有所提升，顶空进样器在避免溶剂峰对分析干扰的同时，也有效减少了有机溶剂对气相色谱系统的污染，降低了维护成本。检测结果也显示各标品曲线的线性关系良好，相应浓度范围相关系数均大于0.999。方法学验证显示本研究建立的方法重复性好、稳定度高。此外，李梦娇等[21]在对植物油中SCFAs含量分析时所用时间为26 min，Umar[22]对益生菌发酵产物中SCFAs含量分析所用时间为20.5 min，而使用顶空进样器进行SCFAs含量的测定，分析时间为16 min，明显缩短了分析测定总时间，且无需样品前处理，在大批量、快速检测应用方面具有明显的优势，适用于发酵液中SCFAs快速测定。