煎炸花生油中的总极性组分对脂质代谢的影响

鞠婧捷，苏青峰，李有栋，李进伟，曹培让，刘元法

(1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122； 2.重庆红蜻蜓油脂有限责任公司，重庆 400010)

油脂深度煎炸是最常见的食品烹饪方法之一。食用油在煎炸过程中发生一系列的化学反应，导致煎炸油的理化指标发生变化，产生氧化甘油三酯、聚合甘油三酯和游离脂肪酸等极性大于甘油三酯的组分，这些极性组分是热氧化油脂劣变最主要的成分[1]。同时，极性组分含量也是衡量油脂质量的主要指标之一[2]。现有关煎炸油的文献大多围绕在稳定性好的饱和油脂体系，如棕榈油[3-4]，而对不饱和油脂体系——花生油的相关研究较少。越来越多的人将花生油作为主要的食用油脂，尤其是我国的北方地区，食品摊位甚至某些成熟的食品店、饭店为了降低费用会使用反复煎炸的花生油，煎炸花生油的使用现状远比我们想象的要严峻。因此，研究煎炸花生油对健康的影响具有一定的现实意义。

目前，煎炸油和极性组分的研究主要集中在开展动物实验，如Li等[5]发现极性组分对昆明种小鼠的脂质代谢有不利的影响，穆昭[6]研究表明极性组分会造成小鼠的骨髓多染红细胞的微核率增加，同时引起脂质代谢紊乱。然而，目前有关极性组分对细胞影响的研究，尤其是脂质代谢方面的研究相对较少。脂质代谢是研究非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的重要前提条件，正如“双重打击”假说所解释的，NAFLD发生的病理机制第一重“打击”主要归因于脂质代谢紊乱[7]。脂质代谢紊乱是指脂质合成和输出的不平衡，可能会促使甘油三酯在肝细胞内积累[8-9]。脂质代谢基因发生异常是导致肝细胞病变的关键控制点。固醇元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)驱动肝脏脂肪生成，是一种控制胆固醇、脂肪酸、甘油三酯和磷脂合成所需的碱性螺旋-环-螺旋转录因子[10]。SREBP-1c通过激活脂质合成所需的基因脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)优先调节从头脂肪生成，而SREBP-1c通过激活胆固醇合成所需的基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)来控制胆固醇体内平衡[11]。HepG2细胞来源于肝细胞癌症患者的肝脏，保留了肝实质细胞的许多形态特征，其特定酶的表达和活性与肝细胞相同，同时HepG2细胞比其他细胞系更敏感[8, 12]。因此，本研究使用煎炸花生油中提取的极性组分，通过HepG2细胞构建脂质代谢的细胞模型，研究极性组分对HepG2细胞的脂质沉积和脂质代谢的相关影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

花生油(不含抗氧化剂)，无锡德合食品科技有限公司；鸡腿，无锡欧尚超市。乙醚、石油醚(沸程30～60℃)、正己烷、甲醇，异丙醇均为分析纯；硅胶(200～300目)，青岛海洋化工有限公司；HepG2细胞，中国上海科学院细胞研究所；油红O，美国索莱宝生物科技有限公司；胰酶消化液，美国Gibco公司;MEM细胞培养基、UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒、AMV第一链cDNA合成试剂盒、2×SG Fast Qpcr Master Mix试剂盒，上海生工股份有限公司。

1.1.2 仪器与设备

EF-818L单缸单筛电炸锅，江苏秉宏生物科技有限公司；Axio Vert A1倒置荧光显微镜，德国蔡司公司；CFX96实时荧光定量基因扩增仪，美国伯乐公司。

1.2 实验方法

1.2.1 煎炸花生油的制备

将7 L花生油置于电炸锅中并保持温度在(180±2)℃，油炸过程中未补充新鲜油。煎炸实验每天开展10 h，连续4 d，每隔1 h换500 g鸡腿进行煎炸,第4天结束时收集煎炸花生油样品，在-20℃避光保存。

1.2.2 极性组分的制备

根据GB 5009.202—2016《食品安全国家标准 食用油中极性组分(PC)的测定》第二法柱层析法制备极性组分，并在此基础上进行改良。先用50 g硅胶装柱，再用洗脱剂A(石油醚-乙醚，体积比87∶13)洗涤硅胶柱。将溶于洗脱剂A的5 g花生油样品倒入柱中同时用洗脱剂A洗脱花生油样品直至非极性组分洗脱完毕，再用750 mL洗脱剂B(乙醚)和250 mL洗脱剂C(甲醇)收集极性化合物，洗脱速度15 mL/min。最后，通过旋转蒸发(40℃)和真空干燥(40℃，0.01 MPa)收集溶解在洗脱剂B和洗脱剂C中的极性化合物。为了更有效地分离极性化合物，使用薄层色谱进行实时监测。

1.2.3 HepG2细胞培养

HepG2细胞均匀分散在含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的MEM细胞培养基的完全培养基中，置于37℃的CO2培养箱中培养。待HepG2细胞融合度达到80%左右，吸除原培养液，用1 mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)清洗2遍，加入1 mL胰酶消化液，放入CO2培养箱中，37℃消化1 min，加2 mL完全培养液终止消化，轻缓地用吸管反复吹打细胞，再全部转移至另一个15 mL离心管中，800 r/min离心5 min，吸除培养液，再加入3 mL完全培养液重新悬浮细胞。细胞计数后取相应数量细胞进行培养。

1.2.4 HepG2细胞的处理

采用细胞计数板计数20×104个HepG2细胞2 mL 并将其接种于六孔板中，培养1 d后细胞完全贴壁，加入质量浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0 mg/mL的极性组分2 mL，对照组不加入极性组分，用无血清的培养基代替，孵育24 h后，用PBS清洗获得极性组分处理和对照组的HepG2细胞。

1.2.5 油红染色

通过油红染色评估HepG2细胞内脂质堆积的情况。将1.2.4获得的HepG2细胞，用10%甲醛固定30 min，然后油红O染料进行染色，PBS洗掉染料后，采用倒置荧光显微镜拍照观察。

1.2.6 实时定量PCR(RT-PCR)

将1.2.4获得的HepG2细胞，使用UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒提取RNA、AMV第一链cDNA合成试剂盒进行反转录和2×SG Fast Qpcr Master Mix试剂盒进行PCR扩增。引物通过Primerbank设计，经上海生工科技股份有限公司合成。引物信息如表1所示。内参基因为β-actin，将每个基因的表达水平进行平均计算，用2-ΔΔCt方法[13]计算不同基因相对于对照基因的相对转录水平的倍数变化。

表1 RT-PCR的引物序列

1.2.7 统计学方法

采用SPSS7．0统计软件进行Duncan’s检验和Anova分析，数据用“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 极性组分对HepG2细胞脂质沉积的影响

图1是用不同质量浓度的极性组分处理HepG2细胞并油红染色的40×显微镜的放大图。

注：A.0 mg/mL; B.0.1 mg/mL; C.0.5 mg/mL; D.1.0 mg/mL; E.2.0 mg/mL。

图1 不同质量浓度的极性组分对HepG2细胞脂质沉积的影响

由图1可见，当不加入极性组分时(图1A)，细胞界限较为明显，细胞浆充足，含有少许红色圆形结构可能是细胞自身存在的脂质，几乎没有油红O的附着，说明不加入极性组分的HepG2细胞产生的脂质很少。随着极性组分含量逐渐增加，脂质沉积情况逐渐加重。当极性组分的质量浓度为0.1 mg/mL时(图1B)，脂质沉积与对照组存在显著不同，但是与极性组分质量浓度为0.5 mg/mL时(图1C)差异不大，红色小泡状的脂滴主要附着在细胞的边缘，细胞并没有大部分被聚积的脂质占满，细胞膜的界限开始不明显，体现了小泡状脂肪生成特征。然而，当极性组分的质量浓度增加到1.0 mg/mL时，被油红O附着的区域进一步扩大，以不均匀的形态分布在胞浆中。当HepG2细胞用2.0 mg/mL的极性组分处理时，不仅是脂质聚积的现象变得更加明显，而且分不清细胞膜的位置，细胞的形态也发生了很大的改变，说明当极性组分的质量浓度达到一定程度时，不仅仅会造成脂质积累还会导致细胞形态的改变，并且造成一定程度的细胞变性。目前鲜有文章报道花生油的极性组分对细胞脂质沉积情况的影响。因此，我们以梯度剂量处理HepG2细胞的方式，观察极性组分对脂质沉积的作用，与极性组分应用到老鼠中的研究结果一致[5]，极性组分不仅会引起老鼠肝脏脂质堆积，也会造成HepG2细胞脂质沉积，这是引发肝脏等相关疾病的第一重关键因素，为证明极性组分引起NAFLD等疾病提供了强有力的证据。

2.2 HepG2细胞的脂质代谢基因表达

研究表明,FAS、ACC和HMGCR是SREBP-1c的下游靶基因[14]。其中，FAS催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成软脂酸，ACC催化乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A，都是控制脂质合成的关键限速酶。这4种脂质合成基因对于调控细胞的脂质代谢有很大的影响，为了检测极性组分对HepG2细胞调控脂质代谢相关基因表达的影响，测定了这4种基因的mRNA水平,结果见图2。

由图2可见，与对照组比较，SREBP-1c和FAS的mRNA的表达均随极性组分质量浓度的增加出现显著性差异(P<0.05)(图2A和图2B)。尽管ACC的mRNA的表达在极性组分质量浓度低于1.0 mg/mL时与对照组差异不显著，但是当极性组分质量浓度进一步增加时，同样出现了显著性差异(P<0.05)(图2C)。一定程度上证明了SREBP-1c对其下游基因FAS和ACC起到了上调作用。由图2D可知，不同质量浓度的极性组分对HMGCR的mRNA的表达水平没有影响，证明了尽管HMGCR基因同样是SREBP-1c的下游靶基因，但是其对HepG2细胞的脂质代谢没有起到调控作用。由此可以认为极性组分在HepG2细胞中通过上调SREBP-1c、FAS、ACC途径引发脂质代谢紊乱。

3 结 论

研究界普遍认为极性组分对健康存在潜在危害，但是造成危害的细胞学的现象和原因却不清楚。本文研究表明：在病理现象方面，极性组分导致HepG2细胞内甘油三酯的积累；在分子水平上，极性组分上调HepG2细胞的SREBP-1c、FAS、ACC脂质合成基因途径，引起脂质合成速率和游离脂肪酸水平的增加，从而导致了脂肪酸合成和分解的不平衡。本研究是首次解释不饱和体系的植物油——花生油产生的极性组分可以导致脂质代谢紊乱，可以用作预防脂质代谢紊乱相关疾病(如NAFLD)的新靶点，并且为研究煎炸油对肝脏疾病的影响提供了新的切入点。