膝骨关节炎实验动物模型现状研究进展

喻珮 刘璐 李志娟 付渊博 袁芳 李彬

[摘要] 参照《實验动物国家标准》将膝骨关节炎模型分为小型动物模型、大中型动物模型及灵长类动物模型，并将国内外常用动物模型依据自发性模型、诱发性模型进行归类。自发性模型包括天然自发模型、转基因模型，诱发性模型分为饮食诱发、药物注射诱发、手术诱发、制动诱发及寒冷诱发。不同模型的选择以及造模方法的应用，各自适用于不同的研究目的。

[关键词] 膝骨关节炎;动物模型;造模方法;研究进展

[中图分类号] R-332          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）09（c）-0041-04

Research progress of experimental animal models of knee osteoarthritis

YU Pei1，2   LIU Lu1   LI Zhijuan1，2   FU Yuanbo1   YUAN Fang1   LI Bin1

1.Department of Acupuncture and Moxibustion， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University  Beijing Key Laboratory of Acupuncture Neuromodulation， Beijing   100010， China; 2.Graduate School， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing   100029， China

[Abstract] According to National Standard for Laboratory Animals， knee osteoarthritis models are divided into small animal models， large and medium animal models and primate animal models. The commonly used animal models at home and abroad are classified according to spontaneous model and induced model. Spontaneous model includes natural spontaneous model and genetically modified model， while inductive model includes diet induction model， drug injection induction model， operation induction model， braking induction model and cold induction model. The selection of different models and the application of modeling methods are suitable for different research purposes.

[Key words] Knee osteoarthritis; Animal models; Induced model methods; Research progress

膝骨关节炎（KOA）是老年多发、以关节软骨退变为主要特征的疾病，在65～75岁人群中发病率达50%[1]，是伴随人口老龄化逐渐成为影响人类健康的重要因素之一。实验动物模型是研究疾病发展必不可少的工具，KOA模型主要分为两类：①自发性模型，指无人为干预自然产生;②诱发性模型，指通过人为干预诱导产生。由于KOA机制复杂，理想动物模型的构建对于研究其发病机制及疗效评价尤为重要。

1 模型分类

1.1 小型动物模型

据《实验动物国家标准》，KOA小型动物模型主要由鼠类构成，早期表现出类似人KOA特征，包括蛋白聚糖丢失、软骨纤维化、骨赘形成等[2]。同时生命周期短，便于观察KOA进程，为研究其病变机制提供了新思路。然而鼠类关节腔较小，造模操作存在难度，指标测量有限制。

1.2 大中型动物模型

大中型动物模型主要包括兔、狗、猪、羊、马，此类模型具有更大关节腔，便于诊断与造模。其中猪的解剖结构、软骨胶原纤维都与人契合度较高[3]，同时转基因技术已被允许应用于猪的转化研究[4]。狗被部分学者认为解剖结构最接近研究标准，也更顺从于术后管理[5-6]。此类模型不足之处在于饲养负担重、疾病进展缓慢、观察周期长、术后管理困难。

1.3 灵长类动物模型

灵长类模型由于生命周期长，且基因组与人相似度高，更适用于实验研究。现今灵长类模型主要选择猕猴类，但猕猴以四肢着地行走为主，与人类发病年龄段不同;且灵长类饲养价格昂贵，条件苛刻，繁殖速度慢，后期进行标本采集时伦理考虑也更困难。

2 模型建立

2.1自发性模型

2.1.1 天然自发模型

部分动物可因自身关节软骨退变形成KOA。Liu等[7]在调查猕猴自发KOA中观察到年老组较年少组膝关节周长增加，软骨厚度降低，软骨细胞减少。Staines等[8]发现，鼠可自发形成KOA，与内在结构、基因控制及母胎影响皆有联系。但自发过程耗时较长，难以应用于实验观察，研究者们为此做出改善，高宁阳等[9]在黑鼠自发KOA基础上强迫跑步30 min/d，KOA自发率显著提高。

2.1.2 转基因模型

随着转基因技术发展，KOA动物模型也可通过转基因实现。Rodriguez等[10]发现，敲除小鼠Col11a1基因，可导致Ⅺ型胶原不能合成正常胶原纤维，诱导KOA。此外还有Col9a1、Col2a1基因，铜转运基因，MMP-13基因，组织特异性BMP-1a型受体，以及ADAM-15基因、MMP-14基因、IL-6基因、Mig-6基因、a-1整合素基因、纤维调节素和基膜聚糖基因双链，纤维调节素和二聚糖基因单链或双链皆可诱发KOA[11]。

然而自发性KOA是由多基因调控产生，转基因模型可能简化疾病过程，因此治疗措施不能相对应用于人KOA治疗中[12]。另外，转基因模型虽对研究KOA发病的特殊基因或蛋白质十分重要，却是由基因异常产生，与劳累、环境等常见因素不符，造模成本也较高，因此能否作为KOA研究或疗效评定的普通模型尚存在争议。

2.2 诱发性模型

2.2.1 饮食诱发

临床病因学显示高脂饮食是一个对于负重或非负重诱发KOA的均相关因素。Lu等[13]发现伴随人膳食结构中总脂肪及饱和脂肪酸摄入的增加，关节间隙逐渐变窄。Brunner等[14]发现，通过增加兔膳食脂肪的摄入，可在不增加体重基础上造成软骨黏多糖含量降低，同时抑制蛋白聚糖酶表达。在实验鼠模型中，高脂饮食可提高瘦素、脂联素水平，同时促进IL-1α分泌，诱导KOA[15]。

2.2.2 药物注射诱发

2.2.2.1 碘乙酸盐（MIA）  MIA可抑制Krebs循环的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，导致软骨细胞死亡[16]。Jacobs等[17]将MIA注入大鼠膝关节腔，4周后观察到大鼠步态畸形，组织病理示关节软骨缺损、细胞排列紊乱，骨赘形成。Nagy等[18]向大鼠关节腔注射MIA，3周后造模组组织病理学评分明显高于对照组，且关节软骨表面分层、缺失，纤维组织排布散乱。

2.2.2.2 木瓜蛋白酶  木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，可分解软骨中的蛋白多糖。Sukur等[19]向大鼠膝关节腔注射木瓜蛋白酶+乙酸钠进行造模，28 d后苏木精-伊红（HE）染色显示软骨表面不规则、裂缝形成，软骨细胞分布不均等KOA改变。Lin等[20]向大鼠关节腔注射木瓜蛋白酶与L-半胱氨酸磷酸盐混合液，12周后通过放射电子显微镜观察到软骨表面破坏，软骨细胞核固缩、坏死等现象。

2.2.2.3 胶原蛋白酶  胶原蛋白酶能破坏软骨内Ⅰ型胶原，使肌腱和韧带中胶原基质减少，造成关节稳态失衡。Nirmal等[21]向大鼠膝关节腔注射胶原蛋白酶Ⅱ，3周后关节软骨部分缺失，关节间隙变窄，组织病理显示软骨表面不规则，骨赘形成及单核细胞浸润等现象。Jeong等[22]向实验鼠关节腔注射胶原蛋白酶进行造模，12 d后发现滑膜液IL-6、TNF-α、IL-1β分泌增多，组织病理示滑膜表面损耗，软骨蛋白聚糖减少，纤维组织排布散乱。

2.2.2.4 尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）  uPA是一种蛋白酶，可降解软骨基质的蛋白多糖，造成软骨破坏。Shuang等[23]将SD鼠随机分至实验组与对照组，实验组关节腔内注射uPA+生理盐水，对照组仅注射生理盐水，于1、2、4、6、8周进行步态分析。实验组行走区域和速度均降低，摇摆步态明显;8周后实验组关节软骨破坏、滑膜细胞增殖明显，同时淋巴细胞浸润、IL-1β、TNF-α分泌增多。

2.2.3 寒冷诱发

寒冷主要通过刺激关节液成分变化来影响滑膜通透性，改变软骨内环境，诱发KOA。刘安军等[24]采用寒冷刺激对小鼠进行造模，30 d后发现造模组关节炎指数明显增高，病理结果及血清透明质酸、TNF-α的升高也表现出典型KOA病变。林强等[25]通过石膏将大鼠四肢固定于4℃凉水中，每日4 h，6周后发现大鼠血清及滑膜组织中IL-1β、TNF-α、PGE2、COX-2及γ干擾素含量均上升。

2.2.4 制动诱发

膝关节长期固定，关节应力发生改变会出现肌肉萎缩、韧带组织紊乱、半月板血流减少等现象，最终导致与临床相似的KOA样改变。Campbell等[26]将实验鼠下肢固定于屈曲位，32周后通过免疫组织染色观察到膝关节前部软骨变薄，COL-Ⅰ增多、COL-Ⅱ减少、血管从软骨转移到软骨下骨生长等现象，提示骨替代了关节软骨的生长。

2.2.5 手术诱发

2.2.5.1 前交叉韧带横断术（ACLT）  ACLT是现今采用较多的构建KOA模型方法之一，主要通过打破关节内稳定性来诱导软骨退变。Tawonsawatruk等[27]通过ACLT对大鼠造模，分别于4、8、12周进行组织病理学评分，造模组明显高于对照组;12周后HE染色显示造模组软骨细胞减少且分布不均。Levillain等[28]利用ACLT对兔进行KOA造模，6周后通过共聚焦显微镜和组织染色观察到关节软骨表面磨损、骨赘形成、软骨纤维排布混乱等改变。ACLT造模成功率高，但仅截断前交叉韧带对膝关节应力破坏较小，常与半月板切除（MMT）搭配使用。

2.2.5.2 MMT  半月板具有稳定膝关节、缓冲震荡、减少摩擦等作用，半月板缺失可导致膝关节稳定性下降、磨损加重。Bagi等[29]对大鼠进行MMT造模，10周后采取膝关节断层扫描，显示软骨表面不规则、局部受损，骨赘形成。Parrish等[30]采取MMT对大鼠进行KOA造模，术后恢复负重，3周后组织病理染色示关节软骨钙化，软骨下骨硬化及骨赘形成等KOA改变。MMT主要影响关节稳定性，与软骨破坏等无直接关系，可用于KOA应力学研究。

2.2.5.3 Hulth法  Hulth法操作是在手术显微镜下打开关节腔，切断内侧副韧带及前后交叉韧带、切除内侧半月板，5周后得到KOA模型。原理为破坏膝关节稳定性造成应力不均，诱导软骨退变。Rogart等[31]利用Hulth法对兔进行造模，分别在3周与14周末对兔关节软骨COL-Ⅱ进行分析，结果显示3周末关节软骨中COL-Ⅱ即开始降解，14周末降解更为严重。

2.2.5.4 膝关节刻痕法  Marijnissen等[32]首先对犬使用圆绞刀进行软骨划痕，于术后强迫以术肢负重，每日4 h，每周3 d，20周后发现局部软骨细胞出现变性、基质中异染物质消失等KOA病理改变。李钊等[33]使用小针刀对兔胫骨平台及股骨髁软骨进行表面刻痕，术后强迫活动30 min/d，5周后HE染色部分软骨面糜烂，软骨细胞减少、分布不均等变化。刻痕法不打开关节腔，减少了手术创伤，成功率高，耗时较短，在研究KOA软骨修复上是一种理想模型。

3 小结

自发性模型不需干预，受到外界干扰较少，可尽量避免操作误差造成的影响，更贴近人KOA进程，但由于进展缓慢限制了在研究中的应用。药物诱发模型操作简单、耗时较短、可重复性高，在短期研究中具有一定可行性。同时具有不破坏关节稳定性，不损伤关节结构等优点，但引发的关节内炎症大多造成软骨细胞的死亡[34]，而人KOA主要以软骨磨损退化、骨赘形成等变化为主，二者在病理上存在一定差异。因此，药物诱发模型更适于研究炎症或疼痛机制，以及疗效评定的观察。

近年手术诱导以病因明确、成功率高、稳定性好成为KOA造模常用方法，主要以破坏关节软骨、半月板或交叉韧带来打破关节稳定性，更加符合创伤性KOA过程，对于研究创伤性KOA软骨保护和修复是一种理想模型。同时，采取多种手术方法联合造模效果优于单一手术造模，且耗时较少[35]。Zhou等[36]比较采用前后交叉韧带、内侧副韧带横断+MMT，ACLT+股骨髁划痕法，单独ACLT对猕猴进行造模。8周后观察到滑膜液WBC、IL-1β、TGF-β1分泌量，关节软骨COL-Ⅱ、ACAN和MMP-13含量以及形态学评分均为前后交叉韧带、内侧副韧带横断+MMT组>ACLT+股骨髁划痕组=老年猕猴自发KOA组>单独ACLT组>假手术组>空白组，表明多种方法联合造模效果优于单一方法。由此可见，在现代研究中应不拘一格，采用更有效的多种方法联合造模，为实验研究创造更多便捷。

[参考文献]

[1]  Lawrence RC，Felson DT，Helmick CG，et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. Part Ⅱ [J]. Arthritis Rheum，2008， 58（1）：26-35.

[2]  Watanabe K，Oue Y，Ikegawa S. Animal models for bone and joint disease. Mouse models develop spontaneous osteoarthritis [J]. Clin Calcium，2011，21（2）：286-293.

[3]  Fan N，Lai L. Genetically modified pig models for human diseases [J]. J Genet Genomics，2013，40（2）：67-73.

[4]  Bendixen E，Danielsen M，Larsen K，et al. Advances in porcine genomics and proteomics--a toolbox for developing the pig as a model organism for molecular biomedical research [J]. Brief Funct Genomics，2010，9（3）：208-219.

[5]  Moreau M，Pelletier JP，Lussier B，et al. A posteriori comparison of natural and surgical destabilization models of canine osteoarthritis [J]. Biomed Res Int，2013，2013：1-2.

[6]  Gregory MH，Capito N，Kuroki K，et al. A review of translational animal models for knee osteoarthritis [J]. Arthritis，2012，2012：764621-764635.

[7]  Liu G，Zhang L，Zhou X，et al. Selection and investigation of a primate model of spontaneous degenerative knee osteoarthritis，the cynomolgus monkey （macaca fascicularis） [J]. Med Sci Monit，2018，24：4516-4527.

[8]  Staines KA，Poulet B，Wentworth DN，et al. The STR/ort mouse model of spontaneous osteoarthritis—an update [J]. Osteoarthritis Cartilage，2017，25（6）：802-808.

[9]  高寧阳，曹月龙，刘婷，等.C57黑鼠骨关节炎模型的关节病理积分与血清及滑膜中基质金属蛋白酶-3、白细胞介素-1水平的相关性研究[J].中华风湿病学杂志，2010， 14（3）：195，插2.

[10]  Rodriguez RR，Seegmiller RE，Stark MR，et al. A type Ⅺ collagen mutation leads to increased degradation of type Ⅱ collagen in articular cartilage [J]. Osteoarthritis Cartilage，2004，12（4）：314-320.

[11]  宋寒冰，赵峰，葛圆圆，等.膝关节骨性关节炎动物模型建立的研究现状[J].中国医药导报，2017，14（30）：46-49.

[12]  Little CB，Hunter DJ. Post-traumatic osteoarthritis：from mouse models to clinical trials [J]. Nat Rev Rheumatol，2013，9（8）：485-497.

[13]  Lu B，Driban JB，Xu C，et al. Dietary fat intake and radiographic progression of knee osteoarthritis：data from the osteoarthritis initiative [J]. Arthritis Care Res （Hoboken），2017，69（3）：368-375.

[14]  Brunner AM，Henn CM，Drewniak EI，et al. High dietary fat and the development of osteoarthritis in a rabbit model [J]. Osteoarthritis Cartilage，2012，20（6）：584-592.

[15]  Griffin TM，Huebner JL，Kraus VB，et al. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice：effects of short-term exercise [J]. Arthritis Rheum，2012，64（2）：443-453.

[16]  云昕矞，于涛.膝关节炎动物模型建立的相关研究[J].世界最新医学信息文摘，2019，19（14）：72.

[17]  Jacobs BY，Dunnigan K，Pires-Fernandes M，et al. Unique spatiotemporal and dynamic gait compensations in the rat monoiodoacetate injection and medial meniscus transection models of knee osteoarthritis [J]. Osteoarthritis Cartilage，2017，25（5）：750-758.

[18]  Nagy E，Vajda E，Vari C，et al. Meloxicam ameliorates the cartilage and subchondral bone deterioration in monoi-odoacetate-induced rat osteoarthritis [J]. Peer J，2017，5：e3185.

[19]  Sukur E，Talu C，Akman YE，et al. Comparison of the chondroprotective effect of a novel hydrogel compound and traditional hyaluronate on rat cartilage in a papain-induced osteoarthritis model [J]. Acta Orthop Traumatol Turc，2016，50（4）：458-463.

[20]  Lin M，Lin Y，Li X，et al. Warm sparse-dense wave inhibits cartilage degradation in papain-induced osteoarthritis through the mitogen-activated protein kinase signaling pathway [J]. Exp Ther Med，2017，14（4）：3674-3680.

[21]  Nirmal PS，Jagtap SD，Narkhede AN，et al. New herbal composition （OA-F2） protects cartilage degeneration in a rat model of collagenase induced osteoarthritis [J]. BMC Complement Altern Med，2017，17（1）：6-17.

[22]  Jeong J，Bae K，Kim SG，et al. Anti-osteoarthritic effects of ChondroT in a rat model of collagenase-induced osteoarthritis [J]. BMC Complement Altern Med，2018，18（1）：131-141.

[23]  Shuang F，Zhu J，Song K，et al. Establishment of a rat model of adjuvant-induced osteoarthritis of the lumbar facet joint [J]. Cell Biochem Biophys，2014，70（3）：1545-1551.

[24]  劉安军，陈宏硕，刘颖芬，等.小鼠骨性关节炎的模型制备及评价[J].中国现代医学杂志，2008，18（8）：1045-1047，1051.