扶正固虚、清热解毒联合疗法对小鼠肝癌的治疗作用及其机制

李曦，曹桢，刘源

(成都中医药大学附属医院，成都 610072)

肝癌是指在肝细胞或肝内单管上皮细胞中发生的恶性肿瘤。根据中国癌症中心发布的研究报告，肝癌发病率和病死率在恶性肿瘤中居前五位[1]。肝癌的治疗方法包括手术切除、肝移植、局部消融治疗、介入疗法等[2]。接受治疗后，很多患者需要坚持使用免疫抑制剂和抗病毒药物，这些药物在杀伤病毒的同时对机体免疫功能会造成不良影响。而中医认为，肝癌多与正气虚损、肝郁、瘀血、痰饮、湿热、热毒等有关，其基本病机是“正虚邪实”。因此，针对肝癌的治疗需要从扶正固虚、清热解毒、疏肝理气、活血化瘀等多方面考虑[3]。吴孝雄等[4]也指出，“扶正祛邪”是治疗肝癌的基本原则，需根据患者病情选择扶正或清热解毒为主。本研究观察了观察扶正固虚、清热解毒联合疗法对小鼠肝癌的治疗作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级昆明小鼠80只，雌雄各半，平均体质量21.22 g，来自成都中医药大学实验动物研究中心。实验过程中对小鼠的处置符合伦理学规定。动物饲养环境安静整洁，温湿度适宜(温度18～24 ℃，相对湿度55%～60%)，光照为12 h光/暗循环。每天更换垫料，每2天添加1次饲料。

1.2 细胞株及主要试剂 Hca-F肝癌细胞株购自中国医学科学院。流式细胞检测抗体和酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒均购自美国R&D公司。

1.3 扶正固虚、清热解毒药物制备方法 扶正固虚药物包括人参15 g、女贞子15 g、山茱萸15 g、白术20 g、黄芪20 g、白芍20 g、陈皮10 g、当归10 g，清热解毒药物包括茵陈30 g、大黄10 g、栀子10 g、黄芩10 g、生地10 g、车前子10 g、柴胡10 g、龙胆草15 g、甘草5 g，将以上药物浸泡1～2 h，煮沸后文火煎20～30 min，过滤取汁，保存以备后用。

1.4 肝癌模型制备及扶正固虚、清热解毒药物给药方法 将Hca-F肝癌细胞株进行复苏并培养，将细胞浓度调整为1×107/mL，之后将培养液注入到5只小鼠的腹腔，每只注射1 mL。接种1周后，使用一次性无菌血液采集装置刺入小鼠腹腔，抽取腹水，将其稀释成浓度为10-7个/mL的瘤细胞悬浮液。在65只小鼠的右侧腹股沟皮下接种0.2 mL瘤细胞悬浮液，接种1周后，将皮下瘤体直径为4～5 mm,造模成功的小鼠筛选出来纳入下一步实验(共49只)。从49只小鼠中选取48只，并将其分为4组各12只，联合治疗组于第2、4、6、8、10、12天腹腔注射15 mL/kg扶正固虚药物和15 mL/kg清热解毒药物，扶正固虚组于第2、4、6、8、10、12天腹腔注射30 mL/kg扶正固虚药物，清热解毒组于2、4、6、8、10、12天腹腔注射30 mL/kg清热解毒药物，肿瘤对照组于2、4、6、8、10、12天腹腔注射0.5 mL生理盐水，另选取12只健康小鼠(设定为空白对照组)，于2、4、6、8、10、12天腹腔注射0.5 mL生理盐水。

1.5 外周血T淋巴细胞亚群及血清细胞因子检测方法 用0.3%的戊巴比妥钠溶液对小鼠进行麻醉，之后眼眶取血2 mL，分装成2管。①T淋巴细胞亚群：取1 mL血，并分别放入2支EDTA-K2抗凝管中，加入CD4-FITC、CD8-PE荧光标记的抗体，充分混匀，避光静置。采用FACS Calibur流式细胞仪检测CD4+T、CD8+T细胞数量，计算两者比值(CD4+T/CD8+T)。②细胞因子：另取1 mL血，并以3 000 r/min的速度离心20 min，收集血清，存于-80 ℃环境保存。采用ELISA法检测血清IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α，具体操作步骤参考相应试剂盒的说明书。

1.6 肿瘤重量称量及抑瘤率计算 小鼠眼眶取血后颈椎脱臼处死，摘取肿瘤，称量给药后肿瘤重量，同时计算抑瘤率，抑瘤率等于肿瘤对照组瘤重与治疗组(设定联合治疗组、扶正固虚组、清热解毒组为治疗组)瘤重的差值除以肿瘤对照组瘤重。

2 结果

2.1 各组给药后肿瘤重量和抑瘤率比较 给药后肿瘤重量和抑瘤率比较见表1。

表1 各组给药后肿瘤重量和抑瘤率比较

注：与肿瘤对照组比较，*P<0.05；与联合治疗组比较，△P<0.05。

2.2 各组给药后外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞百分比及CD4+T/CD8+T比较 给药后外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞百分比及CD4+T/CD8+T比较见表2。

表2 各组给药后外周血CD4+ T细胞、CD8+T细胞百分比及CD4+T/CD8+T比较

注：与肿瘤对照组比较，*P<0.05；与联合治疗组比较，△P<0.05。

2.3 各组给药后血清IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平比较 给药后血清IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平比较见表3。

3 讨论

肝癌是一种起源于肝脏上皮或间叶组织的恶性肿瘤，患者可出现腹痛、恶心、呕吐以及发热等全身症状。目前肝癌的治疗是以外科手术切除为主，抗肿瘤药物治疗为辅的续贯治疗，然而免疫调节剂等抗肿瘤药物可抑制骨髓功能，导致粒细胞减少，同时可引起免疫功能降低，诱发感染等并发症，极大降低了抗肿瘤效果。中医认为，肝癌是由于气滞、血瘀、湿浊、痰凝、湿热、热毒等因素胶合，机体内生癌毒，凝滞气血津液，肝胆恶肉生成所致，据此认为肝癌治疗的关键是去除相关病理因素，消除癌毒[5]。

表3 各组给药后血清IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平比较

注：与肿瘤对照组比较，*P<0.05；与联合治疗组比较，△P<0.05。

扶正固虚是肿瘤治疗的基础，其关键在于调整人体的机能状态，调动内在的抗病机能，为缓解病情或抑制肿瘤创造有利条件[6]。以往研究[7～12]表明，扶正固虚在治疗包括肝癌在内的多种恶性肿瘤中效果很好，能缩小肿瘤体积、减少肿瘤生成、改善患者症状、延缓肿瘤的进展时间、延长生存期、明显提升患者生存质量。由于肝癌邪毒积聚、郁久易化热，清热解毒也成为其常用的治疗手段。贺天临等[13]发现，清热解毒方配合TACE治疗中晚期肝癌能减轻患者疲倦和常见的消化道不良反应，显著提升患者的生存质量，提高6个月与1年的生存率。动物实验也证实，清热解毒中药单体对SMMC-7721肝癌细胞增殖和H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用[14]，但综合分析两者联合作用的研究较少。本研究表明，与肿瘤对照组比较，各治疗组肿瘤重量明显更低，且联合组小鼠的肿瘤重量明显低于扶正固虚组和清热解毒组。抑瘤率方面，联合治疗组的抑瘤率达到56.76%，明显高于其他治疗组，提示联合疗法可明显抑制肿瘤生长。

肿瘤浸润淋巴细胞包括CD4+T细胞亚群和CD8+特异性T细胞亚群，前者也称作辅助性T淋巴细胞，在清除外侵病原体的免疫反应中发挥重要作用，而后者具有细胞杀伤毒性，两者相互调节，共同发挥抗肿瘤作用[15]，两者比值也可反映机体的免疫功能。IL-2和IL-6能促进T细胞增殖，参与抗体反应、机体造血和肿瘤监视。TNF-α和IFN-γ则具有较强的抗肿瘤作用，在癌症治疗中发挥重要作用。本研究表明，与肿瘤对照组比较，其余治疗组的CD4+T和CD8+T细胞数量，CD4+/CD8+比例及细胞因子水平有所增加，且与单独治疗组比较，联合治疗组明显更高，提示治疗后机体免疫功能明显增强，且联合治疗效果更明显，与以往研究[16～18]结果类似。张桂琼等[19]认为，扶正升血颗粒能增加荷H22瘤小鼠免疫器官(胸腺和脾脏)的重量，通过增强淋巴细胞的增殖活性，促进肿瘤小鼠白介素2的分泌，从而增强荷瘤小鼠的免疫功能。一项针对110例晚期原发性肝癌患者的研究发现，健脾扶正汤治疗肝癌效果显著，能提高CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值，明显降低中医证候积分，改善肝功能和免疫功能，提高患者的生活质量[20]。

总之，扶正固虚、清热解毒联合疗法可调节肿瘤小鼠T淋巴细胞亚群平衡，表现为CD4+T细胞和CD8+T数量明显升高，比值升高，多种细胞因子分泌增多，使免疫功能恢复到正常状态，甚至高于对照组，提示扶正固虚和清热解毒联合疗法具有抑制肿瘤进展和改善免疫功能的作用，未来值得在临床推广。