BMP4过表达转基因C57BL/6品系小鼠子代造血干细胞归巢能力观察

张小晴，李娟，柴烁，高梦梦，李玉云

(蚌埠医学院，安徽蚌埠 233000)

造血干细胞移植(HSCT)是目前针对血液系统恶性疾病最有效的治疗措施之一，目前临床报道以及研究显示HSCT仍存在一系列难题，如移植物抗宿主病(GVHD)、HSC稀少导致难以足量提取、以及归巢和重建效率的改善等[1,2]。骨形态发生蛋白4(BMP4)是TGF-β超家族的成员之一，起初被用于骨骼发育，软骨形成等方面的研究[3,4]。骨骼系统和血管系统作为造血微环境的重要组成部分，可对HSC的自我跟新和分化发挥调控作用[5,6]。后随着基因编辑技术的发展，学者们发现BMP4敲除的小鼠会因为造血衰竭而死于宫内，深入的研究发现BMP4能介导中胚层中的造血系细胞的形成，同时在胚胎期注射BMP4可以促进造血集落的形成。从而开启了BMPs在造血系统，尤其是胚胎造血方面的研究，然而BMP4在成熟个体造血或出生后造血调控中发挥的功能还知之甚少，体外实验的结果也不一致。但是已经发现小鼠骨髓中提取的HSC表面存在BMP Ⅰ型和Ⅱ型受体[7]，包括BMP4。因此我们推测，BMP4具有调控出生后造血的功能。但是BMP4在出生后造血调控方面还有很多地方有待研究。本研究选用BMP4过表达的转基因C57BL/6品系小鼠，从HSC归巢角度，探讨BMP4基因在成年个体的骨髓造血中的功能及机制研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8～10周的成年C57BL/6品系小鼠30只，安置于蚌埠医学院实验动物中心的SPF级动物屏障系统内，并按照动物实验中心和蚌埠医学院动物伦理委员会的规章制度进行繁育和实验。野生型小鼠(60只)购于扬州大学实验动物中心。

1.2 主要试剂 Mouse tail DNA mini kit购自成都Foregene公司；PCR引物合成购自南京金斯瑞公司；琼脂糖凝胶购自西班牙Biowest公司；TRIzol®Reagent和DNA ladder购自天津Tiangen公司；SYBR Premix DimerEraser购自日本Takara公司；40 μm细胞滤网购自上海Biologix公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；RBC lysis，PE-lineage抗体，CFSE示踪剂购自美国Biolegend公司；FITC-c-kit抗体，APC-Sca-1抗体购自英国Abcam公司；IGTA-4和VCAM-1抗体购自于美国CST公司，BSA购于德国Biofroxx生物科技，BCA试剂盒和SDS-PAGE试剂盒购于上海碧云天生物技术公司，恩罗沙星购自大连美仑生物；胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.3 BMP4过表达转基因小鼠构建及其繁育后子代的筛选 获取鼠源BMP4基因序列，包括全序列和外显子序列。将外显子序列敲入野生型C57BL/6品系小鼠NSE启动子下游，同时设计跨内含子的引物，使得只有转基因小鼠才有着特异的扩增条带(277 bp)，这一特性也用于BMP4转基因鼠的筛选。由于转基因BMP4鼠在繁育的过程中并不是稳定遗传的，在繁育过程中，子代可能会有BMP4基因的丢失，所以繁育后的子代小鼠在4周龄的时候，需剪取2 mm左右的尾巴或耳朵，裂解其DNA，普通PCR扩增后做琼脂糖凝胶电泳，以100 bp的DNA ladder为Maker,在300 bp左右出现的亮条带为阳性带，同时做阴性对照和阳性对照。筛选出的BMP4子代阳性鼠留下实验，子代阴性鼠全部处死。留下的BMP4阳性鼠和购买的野生鼠分笼饲养繁育。BMP4引物序列：5’-CACTGTGAGGAGTTTCCATC-3’，5’-GTGATGGACTAGTCTGGTGTC-3’。

1.4 子代阳性鼠骨髓HSC归巢能力观察 ①归巢效率：从野生型和转基因型未辐照鼠中各取5只小鼠作为供体鼠，以颈椎脱臼法处死，解剖分离出股骨和胫骨，用组织剪和粗面纱布去除软组织，用2%胎牛血清的PBS进行骨髓腔冲洗，用40 μm孔径的细胞滤网过滤出细胞液，然后牛鲍计数板进行人工计数1×107，用1 mL的PBS重悬，用Lineage-C-kit-sca-1双荧光抗体染色后流式细胞仪对HSC分选，分选出的HSC以每组5×104/只进行尾静脉注射。选取野生型C57BL/6品系小鼠20只，以10 Gy/20g(69.30 cGy/min的频率)的钴60(60co)分两次进行辐照，中间间隔2 h。后随机分为4组各每组5只，转基因1组：BMP4转基因鼠未接受辐照作为供体和野生型辐照小鼠作为受体;野生型1组：野生型未辐照小鼠作为供体和野生型辐照小鼠为受体;阳性对照组：野生型辐照小鼠不接受HSCT，但流式检测前体外CFSE染色;阴性对照组：野生型辐照小鼠不接受HSCT，注射等量PBS。流式细胞仪上机，以空白对照组为基础，以Flowjo软件分析数据，每组BMNC中CFSE阳性区域所占百分比，得出HSC归巢的效率。②造血归巢趋化因子(CXCL12)mRNA：采用RT-PCR法检测。随机选取“①”筛选出的转基因BMP4子代阳性鼠和野生型C57BL/6品系小鼠各3只(分别计为转基因2组和野生型2组)，分别编号，每一只对应相应的离心管。以颈椎脱臼法处死以后进行解剖，分离出双侧股骨和胫骨，用组织钳剪去软组织以后，在含有PBS的研钵中研磨，12 000 r/min离心去上清，每个离心管加入2 mL红细胞裂解液去除红细胞，再次以12 000 r/min 离心去除上清后加入2 mL的TRIzol法提取细胞总RNA，用核酸测定仪测出RNA浓度和纯度，浓度>500 ng/μL，纯度的OD值1.8～2.0可用于后续RNA实验。取≤2 μg进行逆转录，整个过程在冰上进行。逆转录反应条件：42 ℃、60 min，70 ℃、5 min。取逆转录产物按RT-PCR试剂盒说明进行上样，每组设置3个复孔，反应体系：SYBR GreenⅠmix(Rox)10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，RNase-free水补足至20 μL。反应条件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、35 s，40个循环。计算每组平均-2ΔΔCt，ΔCt(n)=Ct目的基因(n)-Ct内参基因(n)；ΔΔCT(n)=ΔCt(n)-ΔCt(1)；然后算出2-ΔΔCT。取3次平均值比较对照组和实验组两种基因的表达水平。CXCL12引物序列：5’-TGCATCAGTGACGGTAAACCA-3’，5’-CACAGTTTGGAGTGTTGAGGAT-3’，内参GAPDH引物序列：5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。③整合素α4(ITGA4)、血管内皮细胞黏附分子1(VCAM-1)蛋白：采用Western blotting法检测。随机选取“①”筛选出的转基因BMP4子代阳性鼠和野生型C57BL/6品系小鼠各3只(分别计为转基因2组和野生型2组)，分别编号，每一只对应相应的离心管，方法同上，只是离心后的沉淀用蛋白裂解液RIPA裂解，BCA法定量检测蛋白的浓度，并做标准曲线。配制制备1.0 mm SDS-PAGE胶，为10%的分离胶和6%的浓缩胶，按照计算的浓度每个泳道加入40 μg总蛋白进行电泳分离，湿转到PVDF膜上，用5%BSA封闭1～2 h，4 ℃一抗过夜，二抗孵育，ECL化学发光试剂自显影。显影后的结果用Image J软件进行扫描灰度值，根据灰度值的大小判断蛋白水平表达的高低，蛋白相对表达水平则为目的蛋白灰度值/内参蛋白的灰度值的百分比(以β-tublin和GAPDH为内参)。

2 结果

转基因1组、野生型1组、阳性对照组、阴性对照组归巢效率(0.352 0±0.0223 0)%、(0.721 0±0.032 0)%、(37.200 0±0.556 0)%、(0.101 3±0.018 0)%，转基因组与野生组、阴性组比较，野生组与阴性组比较，P均<0.05。转基因2组和野生型2组CXCL12 mRNA、ITGA4蛋白、VCAM-1蛋白相对表达量比较见表1。

表1 转基因2组和野生型2组CXCL12 mRNA、ITGA4蛋白、VCAM-1蛋白相对表达量比较

注：与野生型2组比较，*P<0.05。

3 讨论

HSC是一类能维持造血以及造血稳态的多能干细胞，具有各系血细胞分化性并能持续终生。目前HSC已成为血液病、干细胞领域研究的重点对象，临床上采用的HSC移植也是目前治疗血液系统恶性疾病的主要手段。BMP4起初被用于骨骼方面的研究。后随着基因编辑技术的发展，学者们发现BMP4敲除的小鼠会因为造血衰竭而死于宫内，深入的研究发现BMP4能介导中胚层中的造血系细胞的形成，同时在胚胎期注射BMP4可以促进造血集落的形成。从而开启在胚胎造血方面的研究，然而BMP4在成熟个体造血或出生后造血调控中发挥的功能还知之甚少，体外实验的结果也不一致。但是已经发现小鼠骨髓中提取的HSC表面存在BMP Ⅰ型和Ⅱ型受体，其配体包括BMP4。因此我们推测，BMP4具有调控出生后造血的功能。无论BMP4对造血系统有着何种贡献，我们都需要一个理想的活体模型来验证我们的猜想。鉴于BMP4基因敲除的胚胎致死性严重阻碍了学者们的研究进程，我们利用C57BL/6品系小鼠构建了一个神经特异性烯醇化酶(NSE)启动子调控的BMP4(NSE-BMP4)转基因活体模型，在NSE启动子的调控下，上调BMP4的表达水平。因为该品系小鼠强壮适合做模型鼠，另外该NSE-BMP4模型本身就是一个BMP4过表达的活体模型，比较能直观反应BMP4升高的情况下的外周血及造血微环境各方面的改变。由于造血微环境的复杂性，在HSCT过程中HSC迁移和定植的调控我们还不充分了解，而归巢效率和重建功能是评价HSCT的主要标准，直接影响到治疗效果及预后。因此本研究将从HSC归巢的角度，初步探讨BMP4基因再造血系统中所发挥的功能及初步进行机制的探讨。

目前，BMP4已被证实可调控造血相关因子的表达水平。研究[8]通过ChiP和荧光素酶实验验证了BMP4下游的Smads蛋白可结合到CXCL12的启动子，对后者的表达发挥负调控功能。随后Khurana等[9]运用多种BMP4信号通路抗体和抑制剂证明了BMP4存在非经典通路，即Smad蛋白非依赖途径，通过P38-MAPK途径上调HSC的ITGA4的表达水平，CXCL12和ITGA4都可以促进HSC的归巢和定植[10～13]，但是通过的途径不同，CXCL12是通过SMAD途径表达，而ITGA-4则通过P38-MAPK途径表达。TGA4和CXCL12虽都是HSC迁移、动员和定植的辅助因子。前者与造血微环境中的VCAM-1和Fibronectin结合发挥生物学功能，后者作为趋化因子对HSC有着招募和支持的作用。VCAM-1+巨噬细胞亚群是造血祖细胞(HSPCs)的先导细胞[14]，与ITGA4结合促进HSC归巢，但是我们进一步验证BMP4转基因小鼠VCAM-1没有显著性差异，所以我们暂且否定了这个信号的作用。由于BMP4敲除的胚胎致死性[15,16]，Goldman等[17]运用BMP4敲低的模型来研究其在出生后造血中的贡献，通过骨髓和外周血各参数检测，发现BMP4表达水平的降低并没有干扰到生理情况下的造血。因此，BMP4对出生后造血的调控尚存在很大的分歧。而我们在BMP4过表达的转基因小鼠中研究发现，RT-PCR结果显示CXCL12水平是极度降低的，Western blotting检测结果显示ITGA4水平相对升高，VCAM-1没有变化，整体对HSCT的影响是负调节的，不利于HSC归巢。根据造血微环境调控因子表达和功能的异质性，我们推测升高的ITGA4无法补偿CXCL12的下调，从而导致了归巢和重建效率的降低，具体机制有待进一步研究。我们利用CFSE标记HSC注射到辐照小鼠体内追踪HSC的归巢，结果显示BMP4转基因的小鼠与野生型鼠相比HSC归巢效率是降低的。辐照小鼠在接受BMP4转基因鼠的HSCT后造血重建能力也是降低的。因此我们得出结论BMP4过表达的转基因C57BL/6品系小鼠HSC归巢、重建能力与野生型相比是下降的。根据造血微环境调控因子表达和功能的异质性[18,19]，笔者推测升高的ITGA4无法补偿CXCL12的下调，从而导致了归效率的降低，具体机制有待进一步研究。

总之，造血微环境中BMP4水平的上调抑制了HSC的归巢和造血重建能力。因此本研究将为HSCT，特别是中老年恶性血液疾病患者的HSCT治疗提供一定的实验室依据。