不同来源木质素抗氧化活性研究

2019-11-19朱梦妮田维珍周景辉

中国造纸学报 2019年4期

朱梦妮田维珍王兴周景辉李尧，*

（1.大连工业大学轻工与化学工程学院，辽宁大连，116034；2.安徽金楠医疗科技有限公司，安徽合肥，230601）

我国是农业大国，每年会产生数以亿计的农业废弃物，如玉米秸秆和稻壳等。农业废弃物高值化利用的概念由来已久，如以玉米秸秆作为主要原料，通过微生物发酵制备生物乙醇［1］。这些废弃物的再利用不但可以有效减少其焚烧过程产生的环境污染，还可以增加整个产业链的经济利益。这样一来，不仅农民的收入提高，而且农业废弃物也可反哺农业［2］。然而，通过对农业废弃物发酵获得高附加值产品的方法依然会有大量残渣生成。这些残渣主要是由微生物不易分解的木质素所组成。木质素是一种由苯丙烷结构单元通过醚键和碳碳键连接而成的具有三维网状结构的生物大分子。其主要存在于植物的次生壁中，起到了通过形成交织网来支撑植物细胞壁的作用。同时，木质素具有大量芳香烃和酚类结构，可以有效保护植物免受自体呼吸（氧化反应）、外界污染、紫外线照射等因素引起的氧化自由基伤害，即抗氧化作用［3］。

木质素结构中的多酚结构可以有效清除氧自由基，减少细胞损伤，加速周围细胞的新陈代谢，起到抗衰老和加速伤口愈合的作用，可应用在清除自由基面膜和皮肤伤口敷料等领域。然而，不同来源木质素之间存在较大的化学结构差异，从而影响了木质素产品的开发和应用。因此，探索不同来源木质素的化学结构与其抗氧化活性之间的关系就显得尤为重要。

本研究通过氢氧化钠提取法，以玉米秸秆纤维素乙醇残渣、芦苇、核桃壳和稻壳4种农业废弃物作为原料提取木质素，并比较、探究其化学结构与抗氧化活性之间的关系，为木质素的高值化利用提供理论依据。

1 实验

1.1 原料

玉米秸秆纤维素乙醇残渣（Klason木质素：67.6%；酸溶木质素：3.63%；综纤维素：8.91%；灰分：19.9%），中粮集团；芦苇（Klason木质素：19.2%；酸溶木质素：2.36%；综纤维素：73.0%；灰分：5.82%），岳阳泰格林纸集团有限公司；核桃壳（Klason木质素：28.8%；酸溶木质素：2.36%；综纤维素：67.4%；灰分：1.49%），取自新疆；稻壳（Klason木质素：26.5%；酸溶木质素：2.34%；综纤维素：62.3%；灰分：8.82%），取自吉林农村。

1.2 试剂

氢氧化钠（NaOH）、氯仿、吡啶、溴化钾、碳酸钠均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；四氢呋喃，色谱级，天津市光复科技发展有限公司；盐酸，分析纯，沈阳新兴试剂厂；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、无水乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、二甲基亚砜（DMSO）、无水乙醚、磷酸盐、醋酸酐均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；二甲基亚砜（DMSO-d6），分析纯，Sigma公司；没食子酸，99%，阿拉丁；福林-酚，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器

水浴锅，DZKW-4，上海科析试验仪器厂；电子搅拌器，SO20-S，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；离心机，LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司；旋转蒸发器，R501，北票美加力光电设备有限公司；电子天平，ME104E，METTLER TOLEDO；pH计，STARTER2100，奥豪斯仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱仪，Spectrum-B型，常州国华电器有限公司；紫外可见分光光度计，UV1006M031，上海VARIAN光谱分析仪器有限公司；核磁共振光谱仪，Bruker ADVANCE III型，布鲁克科技有限公司；冷冻干燥箱，FreeZone，美国Labconco公司；凝胶渗透色谱仪，Waters 2414，美国Waters公司；高速多功能粉碎机，RHP-600，浙江荣浩工贸有限公司；磁力搅拌器，RET基础型，IKA；恒温恒热磁力搅拌器，DF-101SZ，巩义市科瑞仪器有限公司。

1.4 木质素的提取与纯化

将5 g玉米秸秆纤维素乙醇残渣放入250 mL三口烧瓶，按1∶10的固液比加入10%的NaOH溶液，95℃的条件下水浴1 h。反应结束后用漏斗分离，将固体残渣用NaOH（10%）溶液洗涤两遍。随后将滤液放入200 mL大烧杯中，用盐酸调节混合溶液pH值至2，静置后离心分离并用水洗涤，最后收集沉淀物冷冻干燥。

采取液-液提纯法对上述提取的木质素进行纯化处理［4］。首先，将木质素溶于吡啶/乙酸/水（9∶1∶4，V/V/V）体系中，固液比为1∶28。用氯仿进行少量、多次萃取，收集萃取液旋蒸浓缩。随后将浓缩液缓慢滴加到乙醚溶液中搅拌，有固体生成，在2000 r/min的速度下离心10 min，取沉淀物，真空干燥，即可得到玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素。

以相同的方法提取的芦苇、核桃壳和稻壳木质素样品分别记为芦苇木质素、核桃壳木质素和稻壳木质素。

1.5 木质素的结构表征

1.5.1 红外光谱（FT-IR）表征

取1.0 mg的玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素样品放置于红外灯下光照干燥以除去样品中的水分，然后研磨200 mg KBr粉末，随后取微量木质素样品加入，将二者研磨、压片。将制好的薄片放置于Frontier系列傅里叶变换红外光谱仪进行检测分析。再以相同的方法分别对芦苇木质素、核桃壳木质素和稻壳木质素样品进行红外检测分析。

1.5.2 凝胶渗透色谱（GPC）表征

对上述4种木质素样品进行分子质量检测前需对样品进行乙酰化处理，以增加其在流动相四氢呋喃中的溶解度。木质素乙酰化方法为：将0.1 g的木质素溶于15 mL醋酸酐-吡啶混合液（2∶1，V/V）中，向体系中通入氮气使空气排出后在恒温震荡摇床中室温（25℃）反应72 h。反应结束后将木质素溶液缓慢滴入到200 mL乙醚溶液中，有黄褐色沉淀析出，离心分离黄褐色沉淀即为乙酰化木质素，并用乙醚多次洗涤残留的吡啶，直至无吡啶气味后，置于干燥皿中保持乙酰化木质素干燥备用。

检测时将上述乙酰化木质素样品按10 mg/mL的浓度溶解于四氢呋喃溶液中并采用0.45μm有机系滤头过滤待用。使用Waters 2414型凝胶渗透色谱仪对乙酰化木质素的相对分子质量及分布进行检测。色谱柱型号为串联HR3和HR4，测试分子质量范围为500～600000，凝胶色谱分析条件：聚苯乙烯为标准样，流动相为四氢呋喃，流速1 mL/min，进样体积20μL，柱温35℃，检测器温度35℃。

1.5.3 核磁共振表征

将100 mg乙酰化木质素样品放入0.6 mL DMSOd6溶剂中，采用Bruker ADVANCE III型核磁共振仪对其进行信号采集，采样时间1.4 s，弛豫时间2 s，采样点数64000以及采样次数20000次。

定量13C-NMR谱图分析方法：采用核磁积分的方法对4种木质素中主要的连接键及相对含量予以计算，选取谱图中δC160和δC102之间的芳香族区域积分，并假设该区域为6个碳原子，而且确保该积分的再现性为约5%，其他区域则相对于该值积分，例如羟基［5］。

二维核磁共振（2D-HSQC NMR）分析方法：以100个芳香环为基准。

公式：基准=0.5×S2，6的积分+G2的积分+0.5×H2，6的积分

1.5.4 木质素总酚羟基含量

以没食子酸（GAE）为标准物，采用福林-酚法测定上述NaOH法提取的4种木质素中总酚羟基的含量［6］。取50μL木质素样品（60μg/mL）加入650μL超纯水，再加入50μL福林-酚试剂，混合、摇匀放置5 min，再向混合溶液中加入500μL 7.5%Na2CO3，室温放置90 min。最后，用紫外可见分光光度计测定上述溶液在750 nm处、20～100μg/mL浓度范围内的没食子酸溶液的吸光度。样品的总酚羟基含量用每100 mg木质素含有多少毫克没食子酸来表示，即mg GAE/100 mg木质素。

将紫外可见分光光度计在750 nm处没食子酸标准液的浓度设为横坐标，吸光度设为纵坐标，绘制没食子酸的标准曲线，得到回归方程y=0.00393x+0.00197，R2=0.9993（极显著相关），说明在20～100μg/mL浓度范围内，没食子酸与吸光度有较好的线性关系。因此，可使用该没食子酸标准曲线计算木质素的总酚羟基含量。

1.6 木质素活性测定

1.6.1 木质素的MTT分析检测

采用四唑盐法（即MTT法，又称MTT比色法），检测木质素对小鼠成骨细胞活力的影响。将小鼠成骨细胞培养在含10%胎牛血清（FBS）的K-SFM无血清培养基中，培养条件为37℃，CO2含量5%，相对湿度95%。将4种木质素分别用DMSO溶解，然后配置0.1 mL不同浓度的木质素DMSO溶液（0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 mg/mL）孵育小鼠成骨细胞24 h。然后量取0.02 mL、浓度为2.5 mg/mL的MTT溶液处理小鼠成骨细胞并孵育4 h。去除上清液，加入DMSO溶液，低速震荡10 min。测定上述混合溶液在570 nm处的吸光度。以不添加木质素溶液的小鼠成骨细胞培养组为对照组。

1.6.2 木质素清除自由基能力测定

DPPH是能捕获或清除其他自由基的一种稳定自由基，由于分子中存在多个吸电子的—NO2和苯环大π键，所以能稳定存在。DPPH清除自由基的反应原理是：DPPH中有单电子，在517 nm处有强吸收，使其醇溶液呈紫色。当其他自由基清除剂存在时，其能与DPPH的单电子配对而使DPPH醇溶液的颜色逐渐消失，褪色程度与接收的电子数量成定量关系。

以无水乙醇为溶剂，配制不同浓度DPPH标准溶液（0.06、0.12、0.15、0.18、0.24、0.27、0.30、0.36、0.48 mg/mL），以无水乙醇溶液为参比液，用紫外可见分光光度计测定其在517 nm处的吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制DPPH标准曲线，线性回归方程为y=0.0104x-0.0488，R2=0.99871（相关性显著），说明在0.06～0.48 mg/mL浓度范围内，DPPH与吸光度有较好的线性关系。

配制不同浓度的木质素DMSO溶液（0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL）和质量浓度为0.04 mg/mL DPPH溶液，0～4℃避光保存。取1 mL木质素样品溶液及4 mL浓度为0.04 mg/mL的DPPH溶液于试管中混合、摇匀，室温黑暗放置30 min，每组实验重复3次，以无水乙醇为空白组，用紫外可见分光光度计测定其在517 nm波长处的吸光度A。按公式计算DPPH自由基清除率，清除率越大则木质素抗氧化能力越强；每个实验重复3次，取平均值。

清除率=（A0-A1）/A0×100%

式中，A0为未加木质素样品DPPH自由基吸收峰面积；A1为加入木质素样品后DPPH自由基吸收峰面积［7］。

1.6.3 三价铁离子还原法测定木质素的还原能力

利用三价铁离子还原法测定木质素的还原能力［8］。在试管中分别加入质量浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL的木质素DMSO溶液1.0 mL、磷酸盐缓冲溶液（0.2 mol/L，pH值=6.6）2.5 mL和0.01 g/mL的铁氰化钾水溶液2.5 mL，混合。对照组添加除测试样品外用于反应的所有试剂。混合物在50℃下恒温反应20 min后，铁氰化物还原成亚铁氰化物。然后加入0.1 g/mL的三氯乙酸水溶液2.5 mL，然后以1000 r/min离心10 min终止反应。吸取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.001 g/mL的三氯化铁水溶液。用紫外可见分光光度计，测定样品在700 nm波长处的吸光度。本研究中的木质素（抗氧化剂）能使铁氰化钾的三价铁还原成二价铁（亚铁氰化钾），二价铁（亚铁氰化钾）进一步与三氯化铁反应，生成在700 nm处有最大吸光度的普鲁士蓝（Fe4［Fe（CN）6］3）。因此，测定700 nm处的吸光度可以间接反映抗氧化剂的还原能力，吸光度越大，还原能力越强。

2 结果与讨论

2.1 不同来源木质素结构表征

2.1.1 FT-IR分析

采用红外光谱仪对4种不同来源木质素样品进行分析，扫描范围为400～4000 cm-1，结果如图1所示。由图1可知，4种木质素的基本骨架无明显差异，3440 cm-1处的吸收峰为羟基的伸缩振动峰；2930和2850 cm-1处的吸收峰为—CH3和—CH2的伸缩振动峰；1709 cm-1处的吸收峰为非共轭羰基吸收峰；1326 cm-1处的吸收峰为酚醛结构的—OH弯曲振动峰；1610、1512和1420 cm-1处的吸收峰为芳香骨架振动峰；1085 cm-1处的吸收峰为木质素化学结构中仲醇芳香族醚键的吸收峰；1320、1220和1120 cm-1处的吸收峰为紫丁香基的C—H伸缩吸收峰；1030 cm-1处的吸收峰为愈创木基的C—H伸缩吸收峰。

图1 4种不同来源木质素的FT-IR谱图

2.1.2 定量13C-NMR分析

采用定量13C-NMR对4种不同来源木质素进行表征，其谱图和积分结果分别见图2和表1。由图2和表1可知，化学位移δ位于172.5处的信号峰为羰基，可能来源于酯化的碳水化合物，且δ在90～102区域内，基本没有碳水化合物的信号峰，说明在碱处理过程中，4种不同来源木质素样品的木质素-碳水化合物连接键被大量破坏。本研究实验条件下，酯键容易被破坏，而醚键破坏的几率很低。4种不同来源木质素均出现了G型信号峰：δ149.8（C3，醚化）、δ148.3（C3）和δ115.6（C5）。其S型结构单元的信号峰为：δ152.6（C3/C5，醚化）和δ104.7（C2/C6）。4种不同来源木质素的β-O-4芳基醚键含量分别为0.55/Ar（玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素）、0.67/Ar（芦苇木质素）、0.63/Ar（核桃壳木质素）和0.73/Ar（稻壳木质素）。经计算，4种不同来源木质素β-β和β-5连接键的含量差异较小。

图2 4种不同来源木质素的13 C-NMR谱图

表1 4种不同来源木质素的主要化学位移及定量（13 C-NMR）

2.1.3 2D-HSQC NMR分析

由于定量13C-NMR分析存在一定误差，因此利用2D-HSQC NMR分析进一步说明木质素样品的化学结构。4种不同来源木质素的2D-HSQC NMR谱图如图3所示。由图3可知，4种不同来源木质素的整体谱图基本一致，但有细微差异，如芳环区，玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素、芦苇木质素和稻壳木质素出现较弱的氧化S（S'）结构单元信号，在谱图中没有明显表现。4种不同来源木质素都含有对羟基苯丙烷（H）、紫丁香基苯丙烷（S）和愈创木基苯丙烷（G）3种木质素基本结构单元。在木质素的侧链区，玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素未出现亚结构（Bγ）和与碳水化合物的连接键，说明在提取木质素过程中玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素发生降解。4种不同来源木质素的2D-HSQC NMR谱图定量见表2。由表2可知，4种不同来源木质素中，玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素中的H型结构单元含量最高，S/G值最大；芦苇木质素H型结构单元含量最少。

表2 4种不同来源木质素B的2D-HSQC NMR定量

2.1.4 GPC分析

4种不同来源木质素的分子质量分布、平均分子质量和多分散系数（PDI）如图4所示。由图4可知，4种不同来源木质素的质均分子质量（Mw）没有明显差异，介于3065～3623之间，PDI值相差不大。这可能是由于相同的提取方法只能将同一分子质量分布区间的木质素分离出来。

2.1.5 4种不同来源木质素的总酚羟基含量

总酚羟基含量是反映木质素抗氧化清除自由基能力的重要指标。4种不同来源木质素的总酚羟基含量如图5所示。由图5可知，玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素的总酚羟基含量最高，为40.0 mg GEA/100 mg木质素。其次是核桃壳木质素（31.2 mg GEA/100 mg木质素）、稻壳木质素（28.5 mg GEA/100 mg木质素），芦苇木质素的总酚羟基含量最低，约20 mg GEA/100 mg木质素。这一结果与4种木质素样品的2D-HSQC NMR谱图结构定量结果一致，即H型结构单元含量越高的木质素具有更高的总酚羟基含量。

图3 4种不同来源木质素的2D-HSQCNMR谱图

图4 4种不同来源木质素的分子质量及分子质量分布

图5 4种不同来源木质素的总酚羟基含量

图6 4种不同来源木质素浓度对DPPH自由基清除率的影响

2.2 4种不同来源木质素活性分析

2.2.1 4种不同来源木质素自由基清除能力

图6为4种不同来源木质素对DPPH自由基清除率的影响。从图6可知，4种不同来源木质素对DPPH自由基的清除率随木质素浓度的增大而增大。当木质素浓度为0.4 mg/mL时，4种不同来源木质素对DPPH自由基的清除率在14.9%～55.5%之间，其中，玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素对DPPH自由基的清除率最高，达到53.8%，其他依次为核桃壳木质素、稻壳木质素和芦苇木质素。这一结果与木质素样品的总酚羟基含量测定结果一致。

2.2.2 4种不同来源木质素的还原能力

4种不同来源木质素浓度对其还原能力的影响如图7所示。由图7可知，样品在700 nm波长处的吸光度随着木质素浓度的增大而增大，表明4种不同来源木质素在较高的浓度下对铁的还原能力更强。此外，玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素在各浓度下对应的吸光度均大于其他3种木质素，因此，玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素的铁还原能力最强。当4种木质素溶液的浓度均为1.0 mg/mL时，玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素的吸光度最大，核桃壳木质素次之，然后是稻壳木质素，吸光度最小的是芦苇木质素。

图7 4种不同来源木质素浓度对其还原能力的影响

2.2.3 4种不同来源木质素对小鼠成骨细胞活力的影响

图8显示小鼠成骨细胞在不同浓度木质素溶液中孵育24 h后的细胞活力。从图8可看出，4种不同来源木质素均可提高小鼠成骨细胞活力，且小鼠成骨细胞活力随4种不同来源木质素浓度的增大而提高。当不同来源木质素浓度为3.2 mg/mL时，玉米秸秆纤维素乙醇残渣木质素培养的小鼠成骨细胞的细胞活力明显高于其他3种木质素培育后小鼠成骨细胞的活力，核桃壳木质素培养的小鼠成骨细胞活力次之，稻壳木质素和芦苇木质素培养的小鼠成骨细胞活力相差不大。结合4种不同来源木质素对小鼠成骨细胞活力的影响与其自身化学结构可知，总酚羟基含量高、对DPPH自由基清除率高，则木质素对小鼠成骨细胞活力的提高效果越显著。同时，由于促进小鼠成骨细胞活力提高的代谢途径较为复杂，如木质素化学结构中特定的空间构型和分子质量大小均会对小鼠成骨细胞“吞食”木质素的过程产生影响，从而影响木质素的生物活性，因此木质素的分子质量和连接键结构也可能会影响小鼠成骨细胞活力。