貉源致病性肺炎克雷伯氏菌对喹诺酮类药物耐药表型及耐药基因检测

张召兴 刘少杰 苏硕青 周 琦 贾青辉 张艳英 史秋梅*

(1.河北旅游职业学院畜牧兽医系，承德，067000；2.河北科技师范学院/河北省预防兽医学重点实验室，秦皇岛，066604；)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)是毛皮动物养殖业常见的病原菌之一，该菌主要引起毛皮动物的肺炎、子宫炎及其他化脓性炎症等，其发病率也呈逐年上升趋势，仅次于大肠杆菌(Escherichiacoli)感染，发病率和死亡率均较高，严重影响着毛皮动物养殖业的发展[1-2]。肺炎克雷伯氏菌广泛分布于动物呼吸道、消化道、泌尿生殖道以及水和土壤中，该菌可引起欧洲水貂(Mustelalutreola)、貉(Nyctereutesprocyonoides)、狐(Vulpesspp.)、牛、羊等多种动物及人(Homosapiens)发病，是一种重要的人畜共患的条件致病菌[3]。相关研究表明肺炎克雷伯氏菌通过接合，转化和转导等形式对多种抗生素产生很强的耐药性，并且在同种菌株间进行传播，使其耐药性扩散到其他菌株中，致使该菌呈现多重耐药性[4]。目前，关于肺炎克雷伯氏菌耐药性的报道逐渐增多，应该引起重视。

喹诺酮类药物为人工合成的广谱类抗生素，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有较好的抑菌效果，具有抗菌谱广、抗菌作用明显、安全性较高等多种优点，被广泛应用于畜禽细菌性疾病的防治中，随着喹诺酮类药物在临床中不合理的使用，导致许多病原菌对该类药物产生很强的耐药性[5]。相关研究表明细菌对喹诺酮类药物产生的耐药性与其携带的耐药基因具有一定的相关性[6]。研究喹诺酮类药物耐药机制，减少该类药物耐药性具有很重要的意义。本试验以临床中分离的貉源致病性肺炎克雷伯氏菌为研究对象，对喹诺酮类药物的耐药性与耐药基因进行检测，并分析相关性，探讨其对喹诺酮类药物的耐药机制，为貉肺炎克雷伯氏菌病的防控提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌临床分离菌株，由河北省预防兽医重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂与仪器

营养琼脂、营养肉汤、麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素培养基(MIAC)均购于北京陆桥生化试剂有限公司；左氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星药敏纸片均购自北京天坛药物生物技术开发公司；DNA Marker 2000购于北京中科瑞泰生物科技有限公司；2×ESTaqMaster Mix、ddH2O均购自北京康为世纪生物科技有限公司；梯度PCR仪由德国eppendorf公司生产；隔水式恒温培养箱由上海一恒科学仪器有限公司生产；常用的试剂和仪器设备由本实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌种复苏

将保存于-80 ℃的致病性肺炎克雷伯氏菌接种于麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素培养基(MIAC)上，37 ℃恒温培养12 h，挑取单个菌落于装有5 mL营养肉汤的10 mL管中，37 ℃进行扩大培养至对数期。

1.2.2 药敏试验

取对数期的菌株，调整菌液浓度为106CFU/mL，参照CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)推荐的K-B药敏纸片法对24株致病性肺炎克雷伯氏菌进行药物敏感性试验，抑菌圈直径结果判断以细菌敏感(sensitivity，S)、中介(intermediate，I)、耐药(resistance，R)表示。

1.2.3 细菌基因组DNA的提取

利用水煮法提取，取菌液1 000 μL离心，水洗两遍，加200 μL无菌水放入水浴锅100℃，10 min，取出后离心12 000 r/min，10 min留上清液，备用。

1.2.4 引物设计

参考文献[7]，设计喹诺酮类耐药基因的引物(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 喹诺酮类耐药基因的引物序列

Tab.1 Primer sequences of quinolone resistance genes

1.2.5 耐药基因的PCR检测

以提取的24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌临床分离菌株基因组DNA为模板对9种喹诺酮类药物的耐药基因用降落PCR进行检测。反应体系(50 μL)：2×EsTaqMaster Mix 20 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板4 μL，ddH2O 12 μL；反应条件：预变性：94℃5 min，94℃变性30 s，退火(见表1)℃45 s，72℃延伸70 s，72℃终延伸10 min，30 Cycles。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，将检测结果为阳性的菌株的PCR产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果与GenBank中登录的参考株进行同源性比对。

1.2.6 数据分析与统计

将24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌临床分离菌株对喹诺酮类药物耐药性与携带耐药基因进行统计，分析其相关性，计算其符合率。

2 结果与分析

2.1 喹诺酮类药物耐药性检测结果

由表2药敏试验结果可知，24株致病性肺炎克雷伯氏菌对4种抗生素有很强的耐药性。其中左氧氟沙星的耐药性、恩诺沙星与环丙沙星耐药性均为79.2%(19/24)，诺氟沙星耐药性为75%(18/24)。

表2 24株致病性肺炎克雷伯氏菌对4种喹诺酮类药物的药敏结果

Tab.2 Drug sensitivity of 24 strains of pathogenic Klebsiella pneumoniae to four quinolones

由表3可知，临床分离的24株致病性肺炎克雷伯氏菌的菌株表现多重耐药现象，耐4种抗生素的分离菌株数最多有16株，占分离菌株的66.7%；耐3种抗生素的分离菌株有2株，占分离菌株的8.3%；耐2种抗生素的分离菌株有3株，占分离菌株的12.5%；耐1种抗生素的分离菌株有1株，占分离菌株的4.2%，2株未产生耐药性，占分离菌株的8.3%。

表3 24株致病性肺炎克雷伯氏菌的多重耐药检测结果

Tab.3 24 multidrug resistance test results of pathogenic Klebsiella pneumoniae

2.2 喹诺酮类药物耐药基因检测结果

临床分离的24株致病性肺炎克雷伯氏菌的菌株携带多种耐药基因，9种喹诺酮类抗生素耐药基因均被检测到(图1)。24株致病性肺炎克雷伯氏菌的菌株耐药基因测序结果与GenBank中登录的肺炎克雷伯氏菌参考株的同源性均在98.9%以上。耐药基因gyrB、oqxA检出率为100%，耐药基因gyrA、parC、parE、oqxB、ompF检出率为70.8%—79.2%，耐药基因qnrA、ompC检出率为12.5%—20.8%(表4)。

图1 致病性肺炎克雷伯氏菌耐药基因PCR结果Fig.1 PCR results of drug resistance genes of pathogenic Klebsiella pneumoniae 注：M：D2000 DNA Maker；1-9：Resistance genes oqxA、oqxB、gyrA、gyrB、parC、parE、ompC、ompF、qnrA

由表5可知，24株致病性肺炎克雷伯氏菌的分离菌株均含有多重耐药基因，其中含有9、8、5、3种耐药基因的分离菌株各1株，占分离菌株的7.7%；含有7种耐药基因的菌株为10株，占分离菌株的76.9%；含有6种耐药基因的菌株有6株，占分离菌株的46.2%；含有4种耐药基因的菌株有4株，占分离菌株的30.8%。

2.3 喹诺酮类药物耐药性与耐药基因检测相关性分析

通过对临床分离的24株致病性肺炎克雷伯氏菌株进行耐药表型及耐药基因进行相关性分析。由表6可知，左氧氟沙星药物与耐药基因oqxA、oqxB、gyrA、gyrB、parC、parE符合率为68.4%—100%，与耐药基因ompC、ompF、qnrA符合率较低；恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星3种药物与 耐药基因oqxA、oqxB、gyrA、gyrB、parC、parE、ompF符合率为63.2%—100%。与耐药基因ompC、qnrA符合率较低。

表4 57株致病性肺炎克雷伯氏菌耐药基因检测结果

Tab.4 57 drug resistance genes of Klebsiella pneumoniae

表5 24株致病性肺炎克雷伯氏菌的多重耐药基因结果

Tab.5 24 multidrug resistance gene results of pathogenic Klebsiella pneumoniae

表6 喹诺酮类药物的耐药表型与耐药基因符合率结果

Tab.6 Results of coincidence rate between drug resistance phenotype and drug resistance gene of quinolones %

3 讨论

肺炎克雷伯氏菌属于克雷伯氏菌属一种革兰氏阴性菌，该菌主要分为有肺炎克雷伯菌肺炎亚种、肺炎克雷伯菌鼻硬结亚种、肺炎克雷伯菌臭鼻亚种3个亚种，其中肺炎克雷伯菌肺炎亚种是临床中常见的病原菌[8]。肺炎克雷伯氏菌主要引起毛皮动物的肺部感染，造成严重呼吸道症状，同时还可以破坏其免疫系统，导致免疫器官化脓，降低其免疫力，继发其他的病原感染，其死亡率高达80%以上，成为引起毛皮动物肺炎主要病原菌之一[9-10]。国内许多研究报道了随着抗生素的广泛应用，肺炎克雷伯氏菌对各类抗生素产生了较为严重的耐药性[11]。本试验研究表明，临床分离的24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌对喹诺酮类药物左氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星出现严重的耐药性，其耐药性为70.8%—79.2%，且呈现多重耐药性，其中耐4种抗生素的菌株有16株，占分离菌株的66.7%。说明了临床分离的24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌对喹诺酮产生很强的耐药性，可能由于临床中不合理使用喹诺酮类药物造成的，应该引起重视。与韩坤等[1]、李巧玲等[9]、胡伟等[12]报道的存在一定的差异性，可能与肺炎克雷伯氏菌感染的宿主(蓝狐(Vulpeslagopus)、水貂、人)不同，对喹诺酮类药物敏感性不同，还可能与地区有关。

喹诺酮类药物的耐药性机制与其药物的主动外排、产生抗生素水解酶、生物被膜形成、gyrA和parC基因变异、外膜孔蛋白缺失等多种机制有关[7]。随着抗生素的过度使用，在抗生素药物选择压力下，改变喹诺酮类药物的耐药性机制，致使肺炎克雷伯氏菌对喹诺酮类药物产生耐药性。相关研究表明了氟喹诺酮类药物耐药性与携带的耐药基因有关[7，11-12]。本试验研究表明，24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌的耐药基因gyrB、oqxA、parC、parE、oqxB、ompF检出率在70.8%以上，其他耐基因检出率为12.5%—20.8%，同时携带7、6种耐药基因的菌株最多，分别占分离菌株的76.9%、46.2%。说明分离的24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌携带多种耐药基因，通过分析，左氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星表型与耐药基因oqxA、oqxB、gyrB、parC、parE的符合率为78.9%—100%，其耐药表型与耐药基因之间具有一定相关性。进而证实肺炎克雷伯氏菌的耐药性产生携带的耐药基因(oqxA、oqxB、gyrB、parC、parE)有关，有待进一步研究。本试验为貉肺炎克雷伯氏菌病的防控提供研究基础。