赤大袋鼠馆气载需氧菌分离鉴定及致病性分析

李俊娴 李敏捷 李梅荣 程王琨

(1.南京红山森林动物园，南京，210028；2.南京农业大学，南京，210095；3.成都产品质量检验研究院有限责任公司，成都，610100)

了解并分析赤大袋鼠(Macropusrufus)馆空气中细菌分布情况及污染程度，对空气中细菌的种类以及是否存在致病菌株进行检测可为袋鼠细菌性疾病的感染来源和防控提供参考依据。本试验通过分析袋鼠馆气载需氧菌的种类及致病性，为提高动物园袋鼠生活环境质量、预防袋鼠细菌性疾病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 赤大袋鼠馆笼舍结构及饲养密度

南京红山森林动物园赤大袋鼠馆饲养内舍共6间，为东西走向，南北两侧各3间，每间面积16 m2，中间由工作通道相连接。饲料间1间，面积为16 m2。运动场为露天场地，总面积约1 500 m2。饲养内舍和运动场之间有雨棚遮挡的缓冲道，缓冲道宽约1.5 m。该场馆共饲养赤大袋鼠20只，每年均有繁殖。

1.2 材料

实验动物：普通级小白鼠，6周龄，雌性，18—22 g，购自青龙山实验动物基地。

主要试剂：琼脂糖、核酸染料、DNA Marker DL2000、PCR反应成分为南京喏唯赞生物科技有限公司产品；引物由擎科生物技术有限公司合成；培养基及其他试验试剂为天为生物技术有限公司产品和杭州百思生物技术有限公司产品。

1.3 方法

参照GB/T 18204.3—2013中华人民共和国国家标准公共场所卫生检验方法第3部分空气微生物细菌总数测定中自然沉降法[1]的规定对袋鼠馆的赤大袋鼠馆进行布点采样。春季采样于4月进行，夏季采样于7月进行，秋季采样于10月进行，冬季采样于1月进行。每个季度随机挑选(雨雪天气除外)3—5 d，于10：00—12：00分别在赤大袋鼠馆的运动场、缓冲道、饲养内舍、工作通道和饲料间进行采样。采样时间10 min。培养后按奥梅梁斯基公式[2]计算菌落总数，以CFU/m3报告结果。

1.3.1 气载需氧菌的分离与纯化

每个采样点放置甘露醇氯化钠琼脂(MSA)、麦康凯琼脂(MAC)、志贺菌属琼脂(SS)及兔鲜血平板各1个。采用自然沉降法收集空气细菌，10 min后盖上平皿盖，做好标记尽快转移至实验室37℃恒温培养箱中，倒置培养48 h后观察各培养基中的细菌形态。挑取各培养基上的典型菌落进行涂片，使用革兰氏染色后镜检，初步区分细菌形态和革兰氏染色性质后将初步分离的菌株接种至相应培养基上进一步纯化，直至获得纯菌株。

1.3.2 分离菌的16S rRNA基因鉴定

按照SDS裂解-高盐沉淀法提取细菌的DNA。以细菌基因组DNA为模板，PCR扩增16S rRNA基因。引物参考Kibe等[3]的通用序列，16S-F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S-R 5′-GGTTACCTTGTTAC-GACTT-3′。取PCR反应扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。将电泳结果只有1条清晰条带且产物大小接近1 500 bp的PCR产物送至金唯智生物技术有限公司进行纯化测序，将测得的细菌16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的基因序列进行对比分析。

1.3.3 分离菌的生化鉴定

将MAC和SS培养基上挑出的革兰氏阴性的氧化酶阴性、发酵葡萄糖的杆菌进行肠杆菌科(Enterobacteriaceae)生化鉴定。将MSA及血平板上挑出的革兰氏阳性触酶阳性，氧化酶阴性的球菌做葡萄球菌属(Staphylococcus)生化鉴定。将血平板上挑出的触酶阴性的细菌做链球菌属(Streptococcus)生化试验。将各菌株的生化鉴定结果与《伯杰细菌鉴定手册》中相应的生化结果对照，以生化结果最接近的菌种作为鉴定结果。

1.3.4 动物致病性试验

根据分离菌的16S rRNA测序比对以及生化鉴定结果，从分离的不同菌种中挑选适当数量的菌株进行动物致病性试验。采用活菌培养计数法计数细菌浓度后将试验菌用无菌生理盐水稀释至9×108CFU/mL[4-5]，以0.3 mL/只的量腹腔注射小白鼠，每种细菌做3个重复。对照组小白鼠腹腔注射灭菌生理盐水。接种后观察小白鼠的活动及发病情况，对死亡小白鼠立即剖检。观察病变并挑取肝脏组织划线培养，进行细菌再分离和鉴定工作，若与注入细菌相同则判定为病原菌。未发病的继续观察至1周后统一处死观察病变并进行肝脏组织划线培养，观察是否有细菌生长。

1.3.5 致病菌株抗生素敏感性分析

试验方法参照临床微生物检验标准化操作[6]进行，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)抗菌药物敏感性试验中的M100—S20标准解释结果[7]。

以大肠埃希菌(Escherichiacoli)ATCC25922和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923作为质控菌株，选择阿米卡星(AK)、阿莫西林/克拉维酸(2∶1)(AMC)、阿奇霉素(AZM)、头孢哌酮(CFP)、氨苄西林/舒巴坦(1∶1)(SAM)、头孢西丁(FOX)、头孢曲松(CRO)、头孢噻呋(EFT)、环丙沙星(CIP)、克林霉素(DA)、恩诺沙星(ENR)、红霉素(E)、氟苯尼考(FFC)、庆大霉素(CN)、磺胺甲基异恶唑/甲氧苄胺嘧啶(SXT)，共计15种药物进行试验。肠杆菌科、葡萄球菌属及链球菌属致病菌根据动物园常用药物及CLSI建议使用药物分别选择不同类药物。

2 结果

2.1 赤大袋鼠馆气载需氧菌的四季浓度监测结果

从赤大袋鼠馆测定的气载需氧菌浓度结果见表1。

表1 赤袋鼠馆的气载需氧菌浓度

Tab.1 The concentration of airborne aerobic bacteria in the red kangaroo exhibition

注：表中气载需氧菌浓度的单位为103CFU/m3。同列肩标大写字母不同表示差异显著，同行肩标小写字母不同表示差异显著

Note：The unit of airborne aerobic bacteria is 103CFU/m3.Different capital letter superscripts in the same column show significant difference，different lowercase superscripts in the same line show significant difference

相同季节不同区域之间的菌浓度比较结果为：除夏季工作通道和饲料间两个区域之间菌浓度差异不显著外，春、夏、秋、冬4个季节赤大袋鼠馆的运动场、缓冲道、饲养内舍、工作通道及饲料间5个区域之间的菌浓度均存在显著性差异。赤大袋鼠馆5个区域中夏季饲养内舍菌浓度最高，秋季饲料间菌浓度最高。

相同区域不同季节之间的气载需氧菌浓度对比结果为：运动场夏季菌浓度最高，冬季最低，春、秋、冬三季菌浓度不存在显著性差异；缓冲道夏季菌浓度最高，冬季最低，春、秋两季菌浓度不存在显著性差异，但其他季节之间菌浓度差异显著；工作通道和饲料间菌浓度春、冬两季差异不显著，且菌浓度最低，其他季节之间菌浓度差异显著，工作通道夏季菌浓度最高，饲料间秋季菌浓度最高；饲养内舍春、夏、秋、冬4个季节菌浓度差异不显著。赤大袋鼠馆5个区域中除了饲料间秋季菌浓度比夏季高以外，其他区域夏季气载需氧菌浓度均显著性地高于其他季节。

2.2 分离菌的种类与占比

经生化鉴定及16S rRNA比对结果分析可以得出，本次试验鉴定三大类细菌共计71株(表2)，其中葡萄球菌属细菌最多，共8种37株，占分离菌的52.1%，其中马胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)的分离率14/37显著高于其他葡萄球菌，为赤大袋鼠馆空气中葡萄球菌属的优势菌种。分离到肠杆菌科细菌9个属，10种菌，共计31株，占分离菌的43.7%，其中大肠埃希菌占比最多，为袋鼠馆空气中肠杆菌科细菌的优势菌种。链球菌属细菌仅分离到2种3株，占分离菌的4.2%。在71株菌中，从饲养内舍分离的细菌有44株，其他区域共分离到27株，饲养内舍细菌分离率为62.0%，其他区域细菌分离率为38.0%。饲养内舍环境中肠杆菌科、葡萄球菌属、链球菌属的细菌含量明显高于舍外环境。

表2 分离菌种类与占比

Tab.2 The species and percentage of isolated bacteria

2.3 致病菌株筛选结果

对株菌进行致病性观察试验，分离鉴定结果显示分离菌中马胃葡萄球菌分离率明显高于其他菌种，从中随机选择8株马胃葡萄球菌同其他所有菌株一起，共计65株菌进行致病性观察试验。以菌悬液接种小白鼠后，菌株SA30、CS5、CX11、XL9、CM3、CM34导致小白鼠不同程度发病及死亡(表3)。小白鼠于接种后6 h出现精神萎靡，蜷缩不动，饮食活动减少等症状，其中CM3、CM34组小白鼠饮水稍有增加，垫料中可见少量稀便，发病后期部分小白鼠眼部见大量黏液。部分小白鼠于接种24—72 h内死亡，死亡前被毛逆立，有的出现全身战栗现象。其他小白鼠于接种72 h后逐渐恢复健康。剖检死亡小白鼠发现CS5组部分小白鼠脾脏肿大，CM3、CM34组小白鼠十二指肠充满黄色脓性液体，肠黏膜出血明显，见腹水。SA30、CX11组部分小白鼠肝脏肿大，有出血点，肾脏出血明显。XL9组死亡小白鼠肝脏有不明显出血点，肺和脑均见明显出血。无菌采集死亡小白鼠肝脏组织进行划线培养，发现沿划线处有大量细菌长出，经鉴定与原接种菌一致。

表3 小白鼠发病及死亡情况

Tab.3 The morbidity and mortality of mice

除上述分离菌接种小白鼠出现明显发病及死亡症状以外，其他组分离菌及对照组小白鼠在接种后部分出现精神沉郁现象，但12 h后均无发病症状，且在1周的观察期内均未见明显的发病症状。将所有未死亡小白鼠处死后剖检，均未见明显病理变化，肝脏组织划线培养均未见细菌生长。

由此可知，在分离得到细菌中，2株大肠埃希菌CM3、CM34，1株弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)CS5，2株金黄色葡萄球菌SA30、CX11及1株巴黎链球菌(Streptococcuslutetiensis)XL9，共计6株菌判定为致病菌。其他菌株判定为非致病菌或者致病力较弱的菌株。筛选出的致病菌全部分离自饲养内舍。

2.4 致病菌株的抗生素敏感性分析结果

试验结果显示质控菌大肠埃希菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923对试验药物的抑菌圈大小均在规定值以内，证明此次试验菌的抗生素敏感性试验结果有效。6株试验菌的抑菌圈大小及敏感性结果判定见表4。

表4 致病菌株的药敏结果

Tab.4 The antimicrobial susceptibility testing results of pathogenic strains

注：表中S表示敏感，I表示中介，R表示耐药，-代表未测，/代表未出现抑菌圈

Note：S indicates sensitivity，I indicates intermediary，R indicates resistance，- indicates no detection，/ indicates no inhibition zone

由表结果可知，分离的6株致病菌均对克林霉素耐药，对环丙沙星、氟苯尼考、庆大霉素、恩诺沙星和磺胺甲基异恶唑敏感。此外，不同菌株对不同药物存在不同程度的耐药情况。

3 讨论

3.1 消毒管理及笼舍设计建议

综合分析结果可见，赤大袋鼠馆饲养内舍和饲料间这两个室内区域气载需氧菌浓度明显高于其他区域。袋鼠舍空气中菌含量高可能是因为饲养内舍常有袋鼠活动，夜晚袋鼠聚集于舍内密度较大，排泄物堆积，室内环境空气流动受限造成；饲料间空气菌含量高可能是因为饲料间堆放饲料，通风不畅，且因控制环境湿度和防止饲料污染等原因无法使用液体消毒剂，同时缺乏其他消毒设施，较少进行消毒工作造成。赤大袋鼠馆各个区域一年四季气载需氧菌浓度与温度呈正相关。

建议赤大袋鼠馆在日常管理工作中重点关注细菌污染较严重的饲养内舍及饲料间，及时清扫饲养内舍饲草及排泄物，根据不同季节菌浓度的特点适当调整消毒频率。贮存饲料时不宜将饲料间堆放得过满。建议将饲料摆放于不易霉变的塑料垫板上。应避免将品质不佳的饲料贮存于饲料间内。

根据赤大袋鼠喜欢干燥的自然习性，以及本试验检测结果，袋鼠笼舍设计过程中，建议将饲养内舍建设于干燥、光照充足且通风良好的地方。以减少袋鼠感染致病菌的机会。在场地允许的前提下，适当提高饲养内舍的面积，不仅为动物提供更好的福利，也为降低菌浓度提供硬件条件。建议对饲料间安装温度和湿度控制系统，并安装紫外灯或者臭氧机等消毒设备。在饲料间安装排风扇等强制通风设备，以备在环境条件适宜的时候加强饲料间的通风。

3.2 提高动物抵抗力，减少条件性致病菌感染

本试验在赤大袋鼠馆中分离出肠杆菌科、葡萄球菌属、链球菌属三大类细菌共计71株。其中44株分离自饲养内舍，分离率为62.0%。对分离的细菌进行致病力观察试验判定2株大肠埃希菌，1株弗氏志贺菌，2株金黄色葡萄球菌及1株巴黎链球菌，共计6株菌为致病菌。上述6株菌均为条件性致病菌，且全部分离自饲养内舍。饲养内舍是赤大袋鼠避风取暖的主要场所，故这些条件性致病菌与赤大袋鼠接触几率大，相对接触时间长，引起动物发病的可能性高。在圈养过程中维持饲养环境的相对安静，控制并减少引起动物应激的外在因素，提供合理的饲料，选择合理的管理方式，满足动物的需求，提高动物福利可以一定程度上提高动物的抵抗力，减少条件性致病菌的感染。

3.3 抗菌药物的选择和使用

赤大袋鼠馆空气中的致病菌存在耐药的情况，金黄色葡萄球菌及巴黎链球菌出现多重耐药现象，特别是巴黎链球菌的耐药现象最为严重。在袋鼠患细菌性疾病时，可优先考虑选择环丙沙星、氟苯尼考、庆大霉素、恩诺沙星和磺胺甲基异恶唑等药物进行治疗，并同时进行病原菌分离鉴定及药敏试验，根据药敏试验的结果对治疗药物进行适当调整，以避免不合理地使用抗菌药物。应坚持能用低级别抗菌药窄谱抗菌药时就不用高级别广谱抗菌药，尽可能做到精准使用抗菌药，减少使用抗菌药。