乳酸杆菌与枯草芽孢杆菌联合培养研究

李先磊 吕点点

摘要    本文对乳酸杆菌（HnL-3）和枯草芽孢杆菌（HnB-4）进行了单独培养和联合培养。结果表明，将HnL-3与HnB-4优化后的培养基进行联合培养24 h后得到的菌浓度为4.8×109个/mL，与单独培养时菌液浓度差异不显著。因此，可将2种菌联合培养用于改善动物肠道微环境。

关键词    乳酸杆菌;芽孢杆菌;联合培养;菌液浓度

中图分类号    Q935         文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）18-0165-02                                                                                     開放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    The individual and combined culture of Lactobacillus（HnL-3）and Bacillus subtilis（HnB-4）were studied.The results showed that the concentration of bacterium was 4.8×109/mL after 24 h combined culture of HnL-3 and HnB-4 in optimized medium，and there was no significant difference in the concentration of bacterium between combined and individual culture.Therefore，two kinds of bacteria can be combined cultured to improve the intestinal microenvironment of animals.

Key words    Lactobacillus;Bacillus subtilis;combined culture;bacterial concentration

我国畜牧业发展对经济水平和国民生活质量的提高起到了极大的作用。据统计，我国肉类总产量在1998年跃居世界第一位，肉和蛋的人均占有量超过世界平均水平[1]。同时，在短时间内我国的配合饲料产量大幅增加，一跃成为世界第二饲料工业国。因此，人们对畜产品的关注点从数量变为质量。

动物微生态制剂是对人、动物等有益的生物制剂或活菌制剂。常见的微生态制剂生产菌种包括芽孢杆菌类、乳酸杆菌类、酵母菌类等。乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌已经广泛应用在微生态制剂生产中，但联合使用较为少见，如二者联合培养与单独使用并无区别，则联合培养用于动物微生态制剂的研制，将能更好地改善动物肠道微生态环境，为提高畜产品的质量作出贡献。

1    材料与方法

1.1    试验材料

1.1.1    菌株。乳酸杆菌（HnL-3）、枯草芽孢杆菌（HnB-4），均为湖南理工学院化学化工学院保存菌株。

1.1.2    培养基[2-3]。①MRS培养基。将胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸出物5 g、葡萄糖20 g、乙酸钠5 g、柠檬酸二胺2 g、吐温-80 1 g、磷酸氢二钾0.4 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g分别溶解于1 000 mL水中调节pH值至6.3，113 ℃蒸汽灭菌 30 min。MRS-HG中葡萄糖换成水解糖20 g。②枯草芽孢杆菌培养基。将胰蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、氯化钠10 g分别溶于1 000 mL水后调节pH值至7.2，于121 ℃蒸汽灭菌20 min。LB-C培养基将胰蛋白胨换成玉米浆50 g。③混合培养基（MRS-LB*）。将玉米浆50 g、牛肉膏10 g、酵母浸出物5 g、水解糖20 g、氯化钠10 g、乙酸钠5 g、柠檬酸二胺2 g、吐温-80 1 g、磷酸氢二钾0.4 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g溶解于1 000 mL水中，调节pH值至6.5，113 ℃灭菌30 min。

1.1.3    主要仪器。电子天平（JY3002、BSM320）、双目显微镜（BM2000）、超净工作台（SW-CJ-2D）、恒温培养箱（ZHWY-2102）、电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9076A）、超低温冰箱（U-410）、血细胞计数板等。主要化学药品均使用分析纯。

1.2    试验方法

1.2.1    菌株的活化。将实验室冷冻干燥保存的HnL-3菌粉与HnB-4菌粉（原菌液浓度1.0×109个/mL）1 g用0.85%无菌生理盐水溶解。溶解后分别转入100 mL MRS和LB液体培养基中液体培养48 h，将菌液调至浓度为1.0×108个/mL[4]。

1.2.2    菌株的单独培养。将活化后的乳酸杆菌（菌液浓度1.0×108个/mL）1 mL分别接种到MRS和MRS-HG培养基中，37 ℃培养24 h，用血细胞计数板检测菌液浓度。将活化后的枯草芽孢杆菌（菌液浓度1.0×108个/mL）1 mL分别接种到LB和LB-C培养基中，37 ℃培养24 h，用血细胞计数板检测菌液浓度[4]。

1.2.3    菌株的联合培养及计数。将活化后的乳酸杆菌与枯草芽孢杆菌（菌液浓度1.0×108个/mL）各1 mL接种到联合培养基MRS-LB*中，37 ℃培养24 h，用血细胞计数板检测菌液浓度。

1.2.4    对比培养结果。试验结束后，将不同培养基条件下菌液浓度进行差异分析，评价不同培养基之间的区别。

2    结果与分析

2.1    乳酸杆菌培养结果

活化之后的乳酸杆菌经过培养，培养结果如表1所示。可以看出，用MRS與MRS-HG培养基对乳酸杆菌进行培养时，乳酸杆菌均能正常生长，培养24 h后菌液浓度无明显差异。

2.2    枯草芽孢杆菌培养结果

活化之后的乳酸杆菌经过培养，结果如表2所示。可以看出，用 LB与LB-C培养基对枯草芽孢杆菌进行培养时，枯草芽孢杆菌均能正常生长，培养24 h后菌液浓度亦无明显差异。

2.3    联合培养结果

将乳酸杆菌与枯草芽孢杆菌进行联合培养，培养后平均菌液浓度为4.86×109个/mL。可以看出，用改良后的培养基联合培养乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌时，2株微生物均能正常生长，且培养24 h后总菌液浓度较分开培养时菌液浓度有所提高。

3    结论与讨论

乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌单独培养时采用同样的培养条件，接种浓度和接种量一致，培养后菌液测定采用同型号血细胞计数板和显微镜。而混合培养所用培养基为改良后的培养基，培养条件不变。试验结果显示，单独培养时MRS-HG和LB-C 2种培养基与MRS和LB 2种培养基培养乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌无显著差异，可以替代2株菌的单独培养。联合培养结果说明2株微生物可以在MRS-LB*培养基中正常生长且菌液浓度有一定提高[5-6]。该结果为饲喂试验动物和条件控制提供了帮助，也为更好地制备微生态制剂打下了基础[7-8]。

在进行菌株活化时，应采用生理盐水或适合微生物生长的培养基进行活化。本试验采用生理盐水，是考虑到之后的培养会使用不同培养基进行菌液浓度检测，避免活化时带来的影响。

混合培养时采用的pH值为乳酸杆菌适宜的pH值，主要原因是枯草芽孢杆菌适用pH值范围较乳酸杆菌广，而且枯草芽孢杆菌环境适应能力较强，可以在pH值6.3时正常生长。

4    参考文献

[1] 何明清.我国动物微生态制剂的起源、发展战略及应用前景[J].中国微生态学杂志，2001，13（3）：166-167.

[2] 刘鸽，刘绒欢，刘升兰，等.鸡肠道内乳酸菌的分离鉴定及体外抑菌试验[J].中国动物检疫，2017，34（1）：86-89

[3] 刘宇，尹珺伊，江波涛，等.一株驴源干酪乳杆菌分离、鉴定及生物学特性研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2017，29（6）：16-19.

[4] 钟日聪，刘影，徐春厚.三株产乳酸芽孢杆菌共生培养胞外代谢产物的活性与成分分析[J].湖北农业科学，2017，56（5）：915-918.

[5] 李研东，韩雪，王颖，等.动物微生态制剂的研究进展[J].饲料研究，2008（2）：22-24.

[6] 孔海英，孟宪梅.动物微生态制剂的研究进展及发展应用前景[J].吉林粮食高等专科学校学报，2006（1）：4-7.

[7] 梁东梅，李玉鹏，杜艳芬，等.三株乳酸杆菌的分离鉴定与益生特性研究[J].中国饲料，2018（11）：24-29.

[8] 胡瑞萍，丁贤，李来好，等.响应面法优化枯草芽孢杆菌NHS1产芽孢发酵培养[J].生态学杂志，2018，37（2）：605-612.