常见猪病诊断中口腔液样品采集及注意事项

2019-11-16陈善真叶平王贵平雷宾梅冯彦君林显站陈海辉曹仁祺

中国猪业 2019年7期

陈善真叶平王贵平饶雷宾梅冯彦君林显站陈海辉曹仁祺*

（1广东海大畜牧兽医研究院，广东广州 511400；2桂林联勤保障中心第二储备资产管理局，广西桂林 541000；3阳西县丰沃生态农业有限公司，广东阳江 529800）

口腔液具体指唾液、齿龈分泌物、口腔部创伤分泌物、食物和水的混合物等，其中包括上皮细胞和黏膜细胞、微生物、酶、其他生物活性分子。采集口腔液具有无创、省力、快速、应激少、避免公猪伤害、费用低、无需训练采样技巧、扩大采集样本数量等优势[1]。在人医上采集口腔液已经用于诊断口腔疾病和消化系统性疾病，目前已经从人的口腔液中鉴定出23种病毒和14种病原菌与全身感染性疾病有关，这些病毒包括疱疹病毒、肝炎病毒、HIV等[2]。

在兽医领域，前苏联最早将马的口腔液用于疾病监测。在猪病方面，1976年Corthier首先将猪的口腔液用于猪瘟的检测，对于猪的常见疾病，如非洲猪瘟（ASF）、猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）、猪圆环病毒2型病、流感病毒（IVA）感染、输血传播病毒（TTV1/2）感染、大肠杆菌病、链球菌病、猪肺炎支原体病等都可以通过口腔液做抗原或抗体检测。此外，猪口腔液还可以用于早期诊断，一些传染病的病毒性血症在出现症状前，已经存在于口腔液中，因此将口腔液用于诊断动物的疾病可以比血清样品更早得到结果。

对每栏猪只采集口腔液是传统的采血和采集病料的替代方案，尤其在猪群蓝耳病的抗原和抗体检测和监测中应用较多。Prickett等[3]发现猪口腔液和血液中的PRRSV抗原检测一致性为77%；Graage等[4]通过对口腔液和血清的蓝耳病病毒抗体检测比较，也发现其一致性较高。此外，除了在猪群口腔液中可以做抗原检测，也可以对单头猪只的口腔液做抗体抗原检测。Kittawornrat等[5]在单个公猪试验采样中发现，口腔液相对于血清在检测个体公猪PRRSV中更有优势，认为其可以取代血清检测。本文通过采集猪群口腔液对一些病毒的抗原进行检测，旨在为后期猪病的诊断提供更多思路。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

不同规格棉绳、剪刀、大自封袋、50mLEP管。

1.2 试验方法

猪口腔液采集的主要目的是让尽量多的猪在短时间内尽可能多地咀嚼棉绳。观察猪在1 min内咀嚼棉绳的次数，一般1头猪咀嚼棉绳的时间超过20 s可认为是猪—绳相互作用1次。

口腔液采集流程如下：

①将全棉绳吊系于猪舍的猪栏上，保育猪舍的棉绳以直径1.3 cm为宜，育肥猪或生产公母猪猪舍的棉绳直径以1.6 cm为宜；不同的饲养密度，悬挂的棉绳数量不同，如果一栏饲养猪只数量较少，可以悬挂较少的棉绳，如果一栏饲养猪只数量较多，可以悬挂较多的棉绳，以确保栏内的每头猪只都能咀嚼到棉绳，保证采集足够的口腔液（图1）；

②棉绳悬挂在远离食槽和排便的区域，上端固定，下垂高度与猪只的肩关节齐平，约70 cm高；

③吸引猪只咀嚼，30 min后收取棉绳；

④刮取和挤压棉绳上的口腔液至1 L装的自封袋内，然后再将液体装入50 mL EP管，一般认为大于1 mL口腔液即为有效采集量。

2 影响口腔液采集的因素

2.1 猪群年龄

猪具有群体模仿探究一致性行为。对于肉猪来讲，年龄越大的猪探究行为越强，但妊娠母猪和公猪对棉绳好奇心较差。试验表明，12～14周龄的猪在试验开始15 min后咀嚼棉绳比例明显增加[6]。

2.2 猪群规模

在30 min内，各年龄段猪只咀嚼比例平均为78.5%。猪群规模越大，咀嚼比例越低，其中存栏16～20头猪的栏舍其猪只咀嚼棉绳的比例高于存栏20～26头的栏舍和存栏26头以上的栏舍[7]。

2.3 母猪限位栏

限位栏内母猪平均咀嚼棉绳的时间为2 min 42 s，咀嚼棉绳时间大于2 min的影响因素主要包括稻草铺的地板、大的棉拭子（270 cm2）和操作者[8]。

2.4 咀嚼时间

绝大多数的猪咀嚼时间超过20 s，加上前述78.5%的咀嚼比例，可以认为采集的唾液样品代表了此栏猪的感染状态[9]。

2.5 咀嚼次数

绝大多数的猪咀嚼次数超过1次。

2.6 是否采食

在饲喂前采集猪的唾液样品，猪由于好奇心，相对于采食后，咀嚼比例要高。

2.7 棉绳数量

每栏悬挂多于1条棉绳比1条棉绳咀嚼比例会增高。

3 讨论

3.1 有部分猪不咀嚼棉绳

图1 不同密度猪群采样绳的悬挂

在猪群中，有些猪不会咀嚼棉绳，即使在棉绳上喷洒葡萄糖也无济于事，其原因有待分析。在对群养母猪采样时发现，绝大多数栏，有大于40%的母猪咀嚼棉绳，最少的栏也有10%母猪咀嚼棉绳。有学者用群体采样和单独采样法采集口腔液样品与采集的血样样品进行PRRSV的抗体比较试验，发现单独口腔液采样特异性低于血样，但5个口腔液混样后可提高其抗体特异性。

3.2 采样棉绳的准备

国外具有现成的棉绳样品（St.Josef产品）或者棉拭子或Geno tube（Thermo fisher产品），目前国内杭州贝尔塔兽医诊断实验室有成套唾液采集样品，或是网购。网购棉绳时尽量不选择有染料棉绳，此类棉绳会添加染料，染料会对后续荧光定量PCR反应产生干扰，甚至会出现假阳性结果。棉拭子可以采用人医用的一次性灭菌棉拭子。

3.3 其他采样方式的特点

部分疾病如ASF也可以用鼻拭子、口腔拭子、肛拭子和口腔液检测，鼻拭子采样时因为操作无法确实，结果有时会受影响。口腔液检测因为受多种唾液酶的影响，样品采好后，需立刻冷藏保存运输，且在样品到达实验室后应立即检测，避免当一些病毒的核酸含量低时，核酸分解而出现假阴性结果。以上何种检测方法更敏感或更适合于疫病的早期诊断，还需要进一步研究。

3.4 口腔液采集时的注意事项

①棉绳极具吸水能力，口腔液采集后需要及时将唾液挤出，否则时间过久，口腔液将无法挤出。②采集口腔液时，当栏位数较多时，注意样品间的交叉污染，同时注意标记好每栏编号，以便回溯检查。③口腔液因为其中抗原或抗体含量较少，为避免其降解，需在采样后尽快放置在冰箱，且采样后要求24 h内送达实验室，并在实验室及时检测。