利用基因组编辑技术治疗唐氏综合征探索性研究进展

杨茹清 习海涛 谷峰 赵军招

唐氏综合征（Down syndrome，DS）是最常见的染色体疾病之一，其严重危害人类身体健康，并带来沉重的社会和经济负担。DS至今仍缺乏有效的临床治疗方法，目前主要通过产前筛查和有创性产前诊断降低DS患儿的出生率。本文主要从染色体水平出发，就利用基因组编辑技术治疗DS的探索性研究进展作一综述。

1 DS的现况

DS在1866年首次由Dr.John Langdon Down提出，大量资料显示，其临床症状涉及多个器官系统，主要表现为明显的智能障碍、特殊面容、生长发育障碍、多发畸形以及生活自理能力极度低下等，常伴先天性心脏病，＞50岁的患者多数患有阿尔茨海默病，并且白血病的发病率也较高[1-2]。据资料统计，美国和欧洲的活产DS患儿出生率分别为1/691和1/1 000[3]。统计发现，预产年龄＞30岁的孕妇DS发病率呈指数性增高，到45岁时其DS发病率高达1/30，因此推断DS发病率与女性生育年龄密切相关[4]。近年，随着我国二孩政策的实施，具有生育需求的高龄女性激增，但大多需通过体外受精-胚胎移植（IVF-ET，又称试管婴儿技术）实现妊娠[5]。Frishman等[6]对其生殖中心69例行IVF受孕（单胚移植）的患者在孕15～20周进行产前筛查，发现试管婴儿的DS阳性率是普通人群的两倍。

2 DS目前诊疗方法和致病机制

2.1 临床DS患儿筛查方式 临床上对预产年龄＜35岁的孕妇（除外直接行有创性产前诊断的对象），主要采取产前筛查。早孕期（孕10耀14周）筛查主要是通过母血清学检测，主要包括游离茁-人绒毛膜促性腺激素（茁-hCG）和妊娠相关血浆蛋白-A2（PAPP-A2）[7]。有文献报道，通过多中心联合对入选的75 821例单胎妊娠患者（孕11耀13周+6）辅以超声检测，发现其可降低2%耀3%的假阳性率[8]。无创产前筛查（non-invasive prenatal tests，NIPT）作为近年快速兴起的产前筛查新技术，具有准确性高和灵敏度高、假阳性率低等优势，大多应用于高风险DS的孕妇，同时也适用于预产年龄＜35岁的孕妇[9-11]。但由于其仍存在假阳性率，且检测成本比较高，故至今未能完全替代有创性产前诊断[12]。存在预产年龄＞35岁或夫妻一方携带染色体异常等高危因素时，仍需采取有创性产前诊断，这是诊断DS的金标准[4]。但这是一种侵袭性诊断方法，未能被大众所广泛接受。

2.2 针对DS患者的治疗方法 临床上目前尚无理想的治疗方法，只能在疾病各阶段根据DS患者不同临床表现进行对症治疗。例如治疗DS相关性痴呆可用卡巴拉汀或多奈哌齐等，但不能达到有效缓解且具有明显的不良反应[13]。有研究尝试使用Hedgehog激动剂（sonic hedgehog pathway agonist，SAG）在 Ts65Dn鼠（DS最具代表性的动物模型）上进行实验，发现其可改善N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NM原DA）突触可塑性和提高NMDA/琢-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体敏感性，促进小鼠小脑形态恢复，明显改善小鼠的学习和记忆力，但尚未在临床上普及[14]。

2.3 DS致病机制 DS主要是21号染色体异常所致，由于染色体剂量效应使部分基因异常表达，从而产生临床表型。21号染色体上约有350个基因，但与DS病理表型相关的基因主要集中在21号染色体的长臂上，约有50个区域内的基因与DS病理表现相关，该区域称为“DS关键区域（Down syndrome critical region，DSCR）”[15]。RUNX1是DS神经祖细胞的关键转录调节基因，位于DSCR内，其下调可引起与其密切相关基因的表达水平改变，如 IGFBP5、CCL2、LGR5、FBLN5 和 TLR4，尤其是CCL2[16]。RUNX1基因也可通过使GATA1s基因过表达，促使DS疾病的发生[17]。

3 新型基因疗法

染色体病的治疗至今难以攻克，未能达到有效治愈或缓解。随着基因编辑技术的崛起，研究者开始尝试通过将其致病基因失活或删除额外21号染色体来达到治疗DS的目的。

3.1 抗生素抗性基因筛选 Li等[18]于2012年在21号染色体APP基因位点上引入TK基因，之后通过更昔洛韦（ganciclovir，GCV）筛选，成功筛选出带有TK基因的DS-多能干细胞（Down syndrome-induced pluripotent stem cells，DS-iPSC），使TK在GCV作用下转变为细胞毒性物质，从而破坏该染色体，为临床和基础研究提供新的方向，但是TK基因易突变，很容易产生假阳性和脱靶的发生，且筛选阳性率低，约为10原4。

3.2 21号染色体沉默 Jiang等[19]于2013年提出了一个新的方法，通过锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）将Xist基因插入至DS-iPSCs的21号染色体Dyrk1a位点。Xist基因可引起大范围染色体表达沉默，最终致21号染色体丢失。Xist靶向准确性高达98.5%，能导致21号染色体基因表达受抑制，但可对整个基因表达谱产生影响。2017年，Borensztein等[20]也尝试将非编码Xist基因导入小鼠植入前雌性胚胎的父源性X染色体上，并发现Xist基因也可诱导X染色体失活。但有研究认为此方法不能用于大片段缺失或重复的染色体，也不能完全抑制额外染色体基因的表达，因可致实验结果出现假阴性[21]。

3.3 基因编辑21号染色体 有研究者在2014年诱导环状染色体的形成，在异常染色体长短臂末端分别插入Loxp，在Cre重组酶介导下形成环状染色体，在传代培养过程中可出现靶向染色体丢失，但此方法仍存在一定局限性，尤其在编辑效率上[22]。在2017年，Zuo等[23]通过CRISPR/Cas9-SgRNA靶向染色体上的重复序列（即一条染色体上有多个靶向剪切位点）对小鼠胚胎细胞进行染色体编辑，成功将染色体删除。这种多位点剪切可通过单个sgRNA靶向结合多个特异的染色体位点，或者通过多个sgRNA分别结合各自的特异位点消除特定染色体。通过以上方式，成功将小鼠中多余的X、Y染色体敲除，也能将DS-iPSCs的21号染色体删除。但此研究的脱靶率问题和适用性仍待商榷，且未在人的胚胎干细胞内进行验证（CRISPR/Cas9在人胚胎干细胞的编辑效率较其他类型细胞明显低）。除此之外，此项研究在如何大量引入多个重复序列进行DNA切割，如何预测这些重复序列的切割效率上仍存在局限性。但也有研究认为，与ZFNs、转录激活子效应核酸酶（transcription acti原vator-like effector nucleases，TALENs） 相比，CRISPR/Cas9具有操作简单便捷，费用低的优势[24-25]。随着CRISPR/Cas9基因编辑技术成熟，可尝试将CRISPR/Cas9和Cre/LoxP重组酶系统结合，使其在双重作用下形成环状染色体，通过传代培养多代后，致环状染色体丢失，最终使三倍体细胞恢复至二倍体细胞状态，但目前此方法仍未得到证实。因考虑到若设计在外显子区域，同时作用三条21号染色体，对基因的表达产生影响，可能会影响细胞的生长，不利于后续实验的观察，故尝试选择基因的内含子区域序列设计SgRNA。采用SgRNA专业设计网站（http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/）进行设计，SaCas9设计原则为SgRNA长21bp，PAM序列为NNGRRT，根据网站候选结果选择预测脱靶率低的SgRNA。经基因数据库网站UCSC Blast（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）检测，确定具有较好特异性的sgRNA转染细胞后，由于CRISPR系统作用靶位点后会使DNA产生双链断裂（double strand break，DSB），在无修复模板引入的情况下，DNA可通过非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）进行自我修复[26]。可通过分析Spacer区域套峰情况来评价不同CRISPR/SaCas9-SgRNA活性的高低，从而筛选出相对切割效率高的SgRNA，并用T7E1方法对筛选出来的SgRNA进行验证，之后将筛选出的高效CRISPR/SaCas9-SgRNA靶向21号染色体特定位点，使对应的着丝粒缺失从而删除 21 号染色体（图 1）[27原28]。目前单用 CRISPR/Cas9 基因编辑的效率仍较低，特别是CRISPR/Cas9脱靶问题将阻碍新型基因组编辑的应用[29]。故结合两种系统使染色体发生臂间重组从而去除对应的着丝粒，通过传代培养多代后，致额外染色体丢失（图2）[30]。为了能够引入多个SgRNA进行DNA切割，也有学者提出采用CRISPR/Cas9-腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）来增加细胞感染效率从而提高编辑效率和降低脱靶率，因为AAV可以高保真和对细胞无毒性的特点对人胚胎干细胞进行基因编辑[31]。通过优化转染环境，CRISPR/SaCas9-AAV可针对同源性的靶序列，降低脱靶问题[30]。尽管近年基因编辑技术已得到很大的改进和提升，但如何选择性地去除靶向两条或三条同源染色体中的特定一条染色体（父或母源性染色体），目前仍无有效的应对措施。

图1 高效CRISPR/Cas9编辑步骤（a：高效CRISPR/Cas9-SgRNA编辑方法的过程；b：T7E1方法验证或进一步筛选高效SgRNA）

图2 高效CRISPR/SaCas9-SgRNA和Cre重组酶系统介导的Cre/LoxP编辑过程

我国人口基数庞大，有资料显示DS患儿家庭经济负担为39.00万元，社会经济负担达45.00万元[32]。面对如此高额负担，临床上迫切需要寻找到有效的治疗方法。新型基因编辑技术为染色体及其相关性疾病的治疗提供了可供借鉴的方法，有望为家庭和社会减轻负担。但目前，基因编辑技术仍处于基础实验阶段，其安全性尚未解决,故还存在较大的伦理问题，不能直接应用于临床诊治。

4 小结

总之，DS是最常见、危害最大的染色体疾病之一。大部分患者具有明显的智能落后、特殊面容、生长发育障碍和多发畸形，且动作发育和性发育均延迟，一般生活无法自理。鉴于目前尚无理想的临床治疗方法，只能最大程度地降低DS患者的出生率，且DS患者症状未能有效被控制，因此从根本（染色体水平）上探索治疗DS的新方法显得尤为重要。目前从细胞水平利用新型分子治疗方法来探索DS的治疗尤为热门，CRISPR/Cas9系统与Cre/LoxP重组酶系统介导的染色体工程将为DS等染色体及其相关性疾病的基因治疗奠定一定的基础。但由于目前基因编辑技术在临床试验中涉及伦理问题，其安全性有待商榷，仍需在基础实验上不断摸索。