两例嵌合Y染色体长臂大片段缺失的产前诊断及文献回顾分析

徐丹萍 戴美珍 管荷琴 阮琰 王珺 陈雪君 诸溢扬

性腺的分化源自于胚胎初期的性染色体，而Y染色体在胎儿性腺发育成男性过程中发挥了至关重要的作用。其中位于Y染色体短臂临近末梢位置的SRY基因（sex-determining region Y）就是睾丸决定因子之一。Y染色体的结构异常表现为Y染色体的断裂及其衍生后的异常：缺失、重复、易位、环状染色体和等臂双着丝粒染色体。然而经典细胞遗传学核型分析无法识别Y染色体长臂大片段缺失，将其认为是一种结构异常的标记染色体（marker chromosome，mar）。在围生期发现胎儿mar的重要性在于通过其所保留和丢失的遗传基因，以及这些基因在胚胎生长发育过程中所要发挥的作用，这将更有利于提前预判胎儿表型的变化。本研究联合应用多种技术对两例嵌合Y染色体长臂大片段缺失的胎儿进行产前诊断，并回顾国内外相关文献进行汇总分析，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 例1：女，36岁，G4P1，第一胎女儿已8岁，生长发育正常。孕妇因高龄在孕16周行母亲外周血游离DNA（NIPT）检测，结果提示性染色体异常。在孕20周行羊水穿刺，羊水细胞染色体核型分析。夫妻双方与第一个女儿的外周血染色体核型均正常。三维B超检查胎儿未发现明显异常（无宫内发育迟缓，男性，阴茎正常大小）。 例2：女，22岁，G1P0，孕晚期（29周）因B超检查提示胎儿多囊肾及胎儿宫内发育迟缓就诊，唐氏综合征筛查显示为低风险。由于孕周过大而无法行细胞遗传学核型分析，仅行荧光原位杂交（FISH）和二代测序法检测。夫妻双方外周血染色体核型均正常。B超检查该胎儿未发现阴茎，引产胎儿表型为女性。

1.2 方法 患者签署知情同意书后，在超声定位及引导下，采集羊水细胞进行细胞遗传学核型分析、FISH及二代测序法检测。

1.2.1 细胞遗传学核型分析 羊水细胞经离心后接种到羊水培养瓶中，放入37益二氧化碳培养箱中培养，第7天换液后留悬浮细胞继续培养，常规收获贴壁细胞，胰酶消化后行G显带。

1.2.2 FISH 选用产前诊断染色体检测试剂盒（北京金菩嘉公司）中CSPX探针（绿色，定位于Xp11.1-q11.1）和CSPY探针（红色，定位于Yp11.1-q11.1），滴加于预杂交区域，按说明书进行常规操作。

1.2.3 二代测序法 常规提取羊水细胞DNA，按北京博奥公司提供的操作手册进行片段化酶切、建库、纯化、定量、乳液PCR、产物富集、上机等，之后用软件进行全基因组拷贝数分析。

2 结果

2.1 细胞遗传学核型分析 计数分析100个羊水细胞分裂相，发现例1羊水细胞存在嵌合体，少了一条性染色体，多了一个mar，染色体核型为：45,X[9]/46,X,+mar[91]，见图 1。

图1 例1羊水细胞染色体核型46,X,+mar

2.2 FISH 两例胎儿羊水细胞FISH结果均提示Y染色体存在大片段缺失，具体缺失长度未知且均存在嵌合，嵌合比例分别为90%（图2a）和50%（图2b）。

图2 两例胎儿羊水细胞FISH结果（a：例1，b：例2）

2.3 二代测序法 羊水细胞二代测序法结果提示，例1为45,XO[10]/46,XY,del(Yq11.221-q11.23).[GRCH37/hg19]（17.32Mb-28.78Mb）[90]，例2为45,XO[50]/46,XY,del（Yq11.222-q11.23）.[GRCH37/hg19]（20Mb-28.78Mb）[50]，两份羊水细胞均存在XO嵌合体，但嵌合比例不同，见图3。

图3 两例胎儿羊水细胞Y染色体二代测序图和所有染色体拷贝数水平（a：例1的Y染色体17.32Mb-28.78Mb存在缺失，且Y染色体比X染色体拷贝数低10%左右；b：例2的Y染色体20Mb-28.78Mb存在缺失，且Y染色体比X染色体拷贝数低50%左右）

2.4 妊娠结局 在告知上述结果后，例1孕妇于孕24周、例2孕妇于孕31周中止妊娠，引产儿外表无殊，例2女婴仅生长发育迟缓，其家属均拒绝作进一步的病理检查。

3 讨论

mar的发生率相当低，在新生儿中大概为0.001%，产前诊断的检出率大概为0.004%。1977年Kaluzewski等报道了1例24岁男性患者，因外生殖器发育不全，缺少右侧睾丸就诊，核型分析结果显示45,X/46,XX/46,X,+mar/47,XX,+mar，认为此mar可能为Y染色体。自此，随着研究的进一步深入，越来越多学者关注Y染色体长臂大片段缺失对人体的影响。

在本研究中，例1孕妇羊水细胞中存在2种细胞：45,X和46,X,+mar，mar的嵌合比例达91%，通过FISH及二代测序法确定该mar为Y染色体，且存在大片段缺失。二代测序法仅对功能区域进行测序，结果提示45,XO[10]/46,XY,del（Yq11.221-q11.23）.[GRCH37/hg19](17.32Mb-28.78Mb)[90]，换言之，2.6Mb-17.32Mb 的功能区域均存在，从而表明SRY基因（Y：2654896bp-2652894bp）、AZF（azoospermia factor）区域 a（Y：14.35Mb-15.15Mb）完整存在，而 AZFb（Y：20.11Mb-26.07Mb）和 AZFc（Y：24.98Mb-28.03Mb）则完全缺失。三维B超显示胎儿为男性，不存在宫内发育迟缓的现象，且男性阴茎正常大小。例2孕妇羊水细胞二代测序法结果为45,XO[50]/46,XY,del(Yq11.222-q11.23).[GRCH37/hg19]（20Mb-28.78Mb）[50]，同样SRY基因和AZFa区域完整存在，而AZFb和AZFc区域完全缺失，引产婴儿表型为女性，且B超检查显示胎儿存在宫内发育迟缓现象及多囊肾。

以往文献报道，在明确嵌合Y染色体长臂大片段缺失的病例中，患者社会性别比例（男颐女）为15颐10，大部分男性患者存在正常阴茎但伴有尿道下裂，大部分女性患者存在原发性闭经；有6例女性患者进行SRY基因检测，5例（83.3%）SRY基因表达阳性，其性别可能与Y染色体嵌合有关[1-3]。外周血白细胞中Y染色体嵌合比例越高成为男性的概率越高，XO嵌合比例越高则成为女性的概率越大，但也有例外[4-5]。进一步分析发现这些例外可能与组织嵌合相关，如Petrusevska等[4]报道的1例女性患者，外周血白细胞中Y染色体长臂大片段缺失嵌合比例高达90%（血液源自内胚层），而其皮肤组织嵌合比例低于10%（皮肤源自外胚层）及性腺组织嵌合比例在11%～31%之间（性腺源自中胚层），从而表明胚胎在发育过程中由于不同胚层的嵌合比例不同，从而影响胚胎性别发育。并有文献报道，Y染色体关键区域（AZFa、AZFb和AZFc）的重要基因对男性性腺生成精子起到十分重要的作用，其完全缺失或部分缺失可导致性腺萎缩或无法生成精子；8例成年男性均存在不育史，2例（25.0%）AZF区域均完整，但Y染色体存在缺失，其精液常规检查显示无精子、精子少或精子活动力低下；3例（37.5%）AZFa区域完整，而AZFb和AZFc区域存在缺失，其临床表型为性腺萎缩及精液常规显示无精子，睾丸组织染色可观察到精子；1例（12.5%）AZFa区域缺失，而AZFb和AZFc区域完整，其临床表型为睾丸下降且萎缩，性腺功能减退；2例（25.0%）AZF区域完全缺失，其临床表型为精液常规检查显示无精子，睾丸穿刺未见各级生精细胞及精子[5-9]。此外，综合分析几篇文献可以发现，嵌合Y染色体长臂大片段缺失存活的个体中34.8%（8/23）存在身材矮小的情况，具体原因不明[1，9-13]。

综上所述，嵌合Y染色体长臂大片段缺失不但影响胎儿性别及生长发育，还影响胎儿成年后孕育下一代的能力。目前唐氏综合征筛查及产前超声检测均无法对其进行排查，有一部分胎儿因此而漏诊。本研究对两例嵌合Y染色体长臂大片段缺失胎儿的产前诊断情况作了详细描述，并结合国内外相关文献进行了分析，但目前对嵌合Y染色体长臂大片段缺失的发生机制尚不明确。