双黄连颗粒HPLC指纹图谱及化学模式识别分析

2019-11-15高利利倪健于颖超黄平情庞琳诺曾亚文秦有文韩赓尹兴斌

中国中医药信息杂志 2019年10期

高利利倪健于颖超黄平情庞琳诺曾亚文秦有文韩赓尹兴斌

摘要：目的建立双黄连颗粒HPLC指纹图谱并进行化学模式识别，为其质量评价提供方法。方法样品经50%甲醇提取后，采用HPLC进行检测，以甲醇-0.2%磷酸水为流动相梯度洗脱，流速0.8 mL/min，检测波长278 nm，柱温30 ℃。以对照品及单味药指认共有峰，确定制剂药物的来源归属;对30批样品进行相似度评价、聚类分析及主成分分析。结果双黄连颗粒指纹图谱中确定25个共有峰，通过对照品指认出13个峰。30批样品与对照指纹图谱的相似度为0.827～0.981，聚为两大类。第一主成分贡献率为70.919%，已指认成分有木犀草素、连翘苷、异绿原酸A、黄芩苷、汉黄芩素;第二主成分贡献率为10.835%，已指认成分有隐绿原酸、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、新绿原酸、连翘脂素、绿原酸。结论本研究建立的指纹图谱方法稳定、可靠、重复性好，可用于双黄连颗粒的质量控制。

关键词：双黄连颗粒;高效液相色谱法;指纹图谱;相似度评价;聚类分析;主成分分析

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）10-0060-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.014 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Objective To establish the HPLC fingerprint of Shuanghuanglian Granules and chemical pattern recognition; To provide a method for its quality evaluation. Methods The sample was extracted with 50% methanol and detected by HPLC， methanol-0.2% phosphoric acid as mobile phase with gradient elution; the flow rate was 0.8 mL/min; the detection wavelength was 278 nm; the column temperature was 30 ℃. According to the comparison of reference substances and single medicinal materials， the common peaks was identified， and the source of the preparation-medicinal materials was determined. Similarity evaluation， cluster analysis and principal component analysis were performed on 30 batches of samples. Results Totally 25 common peaks were identified in the fingerprint of Shuanghuanglian Granules， and 13 peaks were identified by reference substances. The similarity between the 30 batches of samples and the reference fingerprint ranged from 0.827 to 0.981， forming two types. The contribution rate of the first principal components was 70.919%， which identified components were luteolin， forsythin， isochlorogenic acid A， baicalin and wogonin. The contribution rate of the second principal components was 10.835%， which identified components were cryptochlorogenic acid， 4，5-O-dicaffeoylquinic acid， isochlorogenic acid B， neochlorogenic acid， forsythiaside and chlorogenic acid. Conclusion The established fingerprint method is stable， reliable and reproducible， which can be used for the quality control of Shuanghuanglian Granules.

Keywords： Shuanghuanglian Granules; HPLC; fingerprint; similarity evaluation; cluster analysis; principal component analysis

雙黄连颗粒由金银花、黄芩、连翘组成，收载于2015年版《中华人民共和国药典》（一部），具有疏风解表、清热解毒功效，用于外感风热所致感冒，症见发热、咳嗽、咽痛[1]。研究表明，方中金银花主要含有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、挥发油类等化学成分，其中绿原酸、咖啡酸、槲皮素、木犀草苷等是抗流感病毒作用的主要活性成分[2];黄芩中的黄芩苷、黄芩素等黄酮类成分具有明显的抗炎解热及抗病毒作用[3];连翘主要含有苯乙醇及其苷类、木脂素类、黄酮类成分，对多种细菌及病毒具有一定的抑制作用[4]。2015年版《中华人民共和国药典》对双黄连颗粒中黄芩苷和连翘苷含量进行了限量要求[1]，目前研究多集中在指标成分定性定量及指纹图谱[5-7]，尚缺乏全面稳定可行的质量控制方法。

中药指纹图谱具有“模糊性”和“整体性”的特点，能够比较全面反映化学成分的种类和数量，表征中药复杂成分与其内在质量之间的关系，在2015年版《中华人民共和国药典》有广泛应用[8]。化学模式识别是化学计量学的重要组成部分，是筛选中药质量标志物的重要数学方法，在中药指纹图谱中的运用日益增多[9-10]。本试验建立双黄连颗粒HPLC指纹图谱，以对照品及单味药指认共有峰，确定制剂药物的来源归属;对所收集的30批不同厂家不同批次样品进行相似度评价、聚类分析和主成分分析，为更好、更全面地控制该产品质量提供依据。

1 仪器与试药

Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司），YP 5002型电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司），MS105 DU型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），SB-5200 DTD型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

绿原酸（批号110753-201716，质量分数以99.3%计）、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸（批号111894-201102，质量分数以94.1%计）、黄芩苷（批号110715-201720，质量分数以93.5%计）、汉黄芩苷（批号112002- 201702，质量分数以98.5%计）、黄芩素（批号111595- 201607，质量分数以98.5%计）、汉黄芩素（批号111514-201706，供鉴别用）、连翘苷（批号110821- 201615，质量分数以94.9%计）、木犀草素（批号111520-201605，质量分数以99.6%计），中国食品药品检定研究院;新绿原酸（批号B21396，质量分数≥98%）、隐绿原酸（批号B21587，质量分数≥98%）、异绿原酸B（批号B21540，质量分数≥98%）、异绿原酸A（批号B21539，质量分数≥98%）、连翘脂素（批号B20726，质量分数≥97%），上海源叶生物科技有限公司。金银花、黄芩、连翘由北京春风药业有限公司提供，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定，分别为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花、唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根、木犀科植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果实;甲醇为色谱纯（美国Fisher公司），水为娃哈哈纯净水。30批双黄连颗粒样品来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Thermo Acclaim 120 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，15%～25%A;10～15 min，25%～28%A;15～25 min，28%～35%A;25～35 min，35%～45%A;35～65 min，45%～60%A;65～80 min，60%～85%A），流速0.8 mL/min，检测波长278 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液

取本品，研细，取约1.2 g/0.6 g（无蔗糖），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇30 mL，称定质量，超声（功率300 W，频率40 kHz）提取30 min，放冷，加50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 混合对照品溶液

精密称定绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、4，5-0-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷、连翘脂素、木犀草素对照品适量，加50%甲醇制成含绿原酸49.3 μg/mL、新绿原酸51.6 μg/mL、隐绿原酸45.6 μg/mL、4，5-0-二咖啡酰奎宁酸45.5 μg/mL、异绿原酸B 52.0 μg/mL、异绿原酸A48.0 μg/mL、黄芩苷45.3 μg/mL、汉黄芩苷48.9 μg/mL、黄芩素49.6 μg/mL、汉黄芩素48.0 μg/mL、连翘苷54.7 μg/mL、连翘脂素54.8 μg/mL、木犀草素42.8 μg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.2.3 单味药供试品溶液

按处方比例分别称取各单味药粉末（过4号筛），精密称定，按“2.2.1”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取双黄连颗粒样品（S2），按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以4号色谱峰为参照，经计算得到各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于3.7%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取双黄连颗粒样品（S2）6份，按“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以4号色谱峰为参照，经计算得到各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于3.7%，表明方法重复性良好。

2.3.3 穩定性试验

取双黄连颗粒样品（S2），按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，记录色谱图。以4号色谱峰为参照，经计算得到各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于3.7%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱的建立

取30批双黄连颗粒，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。将得到的S1～S30图谱导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行分析，以S2图谱作为参照，采用中位数法，时间窗宽度为0.2，经多点校正后全谱峰匹配，生成对照指纹图谱，见图1。根据检测所得图谱，确定25个共有峰。选择保留时间适中、分离度较好的4号峰作为参照峰（S）。30批双黄连颗粒指纹图谱见图2。

2.5 共有峰的归属与指认

分别取各单味药供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析。结果显示，1、3、4、5、7、8、9、10、11、12号峰来源于金银花，7、15、16、17、18、19、21、22、23、24、25号峰来源于黄芩，2、3、6、7、8、11、13、14、20号峰来源于连翘。通过与混合对照品图谱对比，指认1号峰为新绿原酸，4号峰为绿原酸，5号峰为隐绿原酸，9号峰为异绿原酸B，10号峰为异绿原酸A，12号峰为4，5-0-二咖啡酰奎宁酸，13号峰为连翘苷，16号峰为黄芩苷，18号峰为木犀草素，19号峰为汉黄芩苷，20号峰为连翘脂素，22号峰为黄芩素，24号峰为汉黄芩素，见图3。

2.6 相似度分析

30批双黄连颗粒样品与对照指纹图谱的相似度为0.827～0.981，S1～S13与对照指纹图谱的相似度为0.910～0.981，S14～S30与对照指纹图谱的相似度为0.827～0.979，见表2。表明所建立的对照指纹图谱特征性较强，不同厂家、不同批次样品间存在一定差异，可能为生产过程中因操作人员或操作工艺参数不同导致。

2.7 化学模式识别

2.7.1 聚类分析

运用SPSS19.0统计软件，以25个共有色谱峰相对峰面积数据为变量，Z标准化后，以平方Euclidean距离为度量标准，采用Ward法对30批双黄连颗粒样品进行系统聚类分析。结果表明，类间距介于5～25时，30批样品聚为两大类，S1～S13聚为一类，S14～S30聚为一类，见图4。

2.7.2 主成分分析

运用SPSS19.0统计软件，以25个共有色谱峰相对峰面积数据为变量，特征值>1为提取标准，得到前4个主成分，累计贡献率为91.520%，见表3。根据主成分载荷矩阵（见表4），确定第一主成分中载荷量较大的13个变量，分别为21、8、6、23、18、25、7、13、10、17、16、3、24号峰，表明第一主成分主要反映了这些成分的信息，其中18号峰为木犀草素，13号峰为连翘苷，10号峰为异绿原酸A，16号峰黄芩苷，24号峰为汉黄芩素;同理，第二主成分主要反映了2、5、12、9、1、20、4号峰这7个成分的信息，其中5号峰为隐绿原酸，12号峰为4，5-0-二咖啡酰奎宁酸，9号峰为异绿原酸B，1号峰为新绿原酸，20号峰为连翘脂素，4号峰为绿原酸。以4个主成分（PC1～PC4）所对应的方差贡献率占所提取主成分的累计方差贡献率的比例作为权重，计算主成分综合模型为Y=0.774 9PC1+0.118 4PC2+0.055 0PC3+0.051 7PC4，通过模型计算每个样本的综合得分，按分值高低对样本进行排序，结果见表5。

3 讨论

中药指纹图谱应以尽量多检测出样品的有效成分、洗脱尽量多的色谱峰，且分离度良好为指标。本试验分别考察了50%甲醇、甲醇提取溶剂及30、45 min超声提取时间对提取效果的影响，结果表明，以50%甲醇为提取溶剂，超声30 min即可。本试验比较了甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.25%冰乙酸、甲醇-0.4%磷酸、乙腈-水和乙腈-0.2%磷酸系统对指纹图谱的影响，结果甲醇-0.2%磷酸流动相系统所得指纹图谱中各色谱峰的分离情况和峰形较好。通过DAD检测器在190～400 nm进行全波长扫描，发现在278 nm波长处色谱峰多，可代表的信息较全面，色谱峰基线平稳且各色谱峰分离较好，因此选择278 nm作为指纹图谱的采集波长。本试验考察了3种不同型号的色谱柱Acclaim 120 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），各组分在3种型号色谱柱中出峰顺序一致，分离情况差别不大，综合分离度、拖尾因子等因素，最终选择Acclaim 120 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。试验比较了流速分别为0.8、1.0 mL/min所得图谱，结果流速为0.8 mL/min时所得指纹图谱中各色谱峰分离较好。

双黄连颗粒中黄芩苷成分含量较高，在相似度计算时权重较大，但指纹图谱间的细微差异可能才是质量评价的关键。在黄芩苷峰参与积分的条件下，30批双黄连颗粒指纹图谱与对照指纹图谱相似度均在0.997以上，而在黄芩苷峰不参与积分的条件下，相似度在0.827～0.981，能反映出差异。因此在相似度计算中，可通过屏蔽强峰积分的方法，更好地体现不同厂家、不同批次样品间的质量差异。这种屏蔽强峰的相似度评价方法对于化学成分差异细微的药材及制剂有很好的鉴别意义[11]。

聚类分析常用于数据的初步探索性分析，有直观、结论形式简明的优点;主成分分析为双线性模型方法，利用方差最大原则，对原始数据所包含的多个自变量进行线性拟合，以新的低维变量代替原始高维变量，即主成分，主成分之间互不相关，从而使这些主成分能够反映原始变量的绝大部分信息，且所含的信息互不重叠，实现数据的降维[12]。本试验以30批双黄连颗粒指纹图谱的25个共有色谱峰相对峰面积数据为变量，进行聚类分析和主成分分析，结果可将样品聚为两类，与样品来源厂家一致。第一主成分贡献率为70.919%，主要反映了13个峰的信息，已指认成分有木犀草素、连翘苷、异绿原酸A、黄芩苷、汉黄芩素;第二主成分贡献率为10.835%，已指认成分有隐绿原酸、4，5-0-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、新绿原酸、连翘脂素、绿原酸。研究结果提示，指纹图谱结合多指标成分含量测定能更全面评价双黄连颗粒的质量，为其质量控制提供依据。

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