勿色杆菌和假单胞菌对原油降解特征对比＊

徐荣德 万云洋，3 陈践发 王晓梅 苏 劲

(1.中国石油大学(北京)地球科学学院；2.油气资源与探测国家重点实验室；3.油气污染防治北京市重点实验室；4.中国石油勘探开发研究院)

0 引 言

在原油的开采、储运过程中，油品的泄漏通常会造成土壤污染，石油烃类污染已成为石油石化行业土壤污染的主要形式之一。在众多石油烃污染土壤的修复方法中，微生物修复法具有高效率低成本、无二次污染、应用范围广泛及不破坏生态环境等优点，已成为土壤修复的主流技术之一[1-2]。

已报道原油降解菌共约100余属200多种，尚缺针对革兰氏阴性菌(G-)和革兰氏阳性菌(G+)石油烃降解的系统对比研究。其中G-假单胞菌属(Pseudomonas)和G+勿色杆菌属(Achromobacter)[3]均为较常见的原油降解菌[4-6]。以往的部分报道认为，假单胞菌属对原油降解效率更高[7-8]，且对苯、萘及荧蒽等高分子量多环芳烃有较强的降解能力[9-11]，而勿色杆菌属对原油的降解效率相对偏弱，但有较宽的烷烃降解谱[12]。

本文通过从胜利油田油污土壤中分离筛培出的纯菌黄色假单胞菌(Pseudomonasflavescens)和勿色杆属菌种(Achromobatersp)在实验室条件下模拟土壤环境中原油微生物降解。首次分析原油降解气组分变化特征并结合降解油族组分及饱和烃生物标记化合物特征，对比分析G+和G-的降解特征，为原油烃类污染土壤的微生物修复提供理论依据与技术参考。

1 材料与方法

1.1 原油样品及菌种来源

原油样品取自塔里木油田TH13-C井未遭受生物降解的海相原油，饱和烃组分含量约为69%，芳烃含量25.8%。菌种来自胜利油田现场油浸土壤，以原油为唯一碳源，经富集和选择性培养获得的原油降解菌。降解菌经分离获得两株纯菌，经鉴定分别为革兰氏阳性勿色杆属菌种(Achromobatersp) SLTHX114株和典型原油降解耗氧革兰氏阴性黄色假单胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214株。培养基配置及菌种富集如下[13]：

1)配制液体培养基。取酵母膏0.5 g、胰朊胨1.0 g、NaCl 0.5 g置于200 mL锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水配得液体培养基。平均分配到两个100 mL锥形瓶中后封口并高温高压灭菌30 min左右。

2)石油降解菌摇菌。待培养基灭菌完毕冷却至室温，然后分别向两个锥形瓶中接入SLTHX114株和SLTHX214株两种石油降解菌。使菌浓达到109个/mL，于4℃下保存。

1.2 原油生物降解模拟实验

将油气运聚地球化学示踪物理模拟子系统的管线转换成并联模式，清洗高压管并干燥，微生物降解模拟实验示意见图1。用蒸馏水将已经过酸碱处理过的石英砂反复冲洗后置于马弗炉内干燥。取适量石英砂和40 mL原油充分搅拌混合后平均装于4个高压管中并编号M1、M2、M3和M4号。向M1和M2号高压管中各加入20 mL石油降解菌SLTHX114株，向M3和M4号高压管中各加入20 mL石油降解菌SLTHX214株。最后在M1号和M3号高压管中各加入20 mL微生物营养液[14]。密封高压管，常压、温度调节至40℃。每隔1周通空气并在第4周和第8周分别收集原油降解气及中间降解原油样品，对气体组分、油样族组分、饱和烃色质进行定量分析。同时设置M0作为空白对照样。接种SLTHX114株并加入营养液的高压管发生泄漏导致M2号实验数据无效。

图1 微生物降解模拟实验示意

1.3 GC-MS、GC-FID分析

气体组分分析使用美国Vasson公司的US10917013-7890A型微量气相色谱仪，每次进样2 mL。检测条件：进样温度为200℃，检测器(FID)温度310℃，气体分析温度为50℃，运行时间20 min；以氦气为载气，流速1 mL/min[15]。

降解的油水混合物进行油水分离，用正己烷沉淀沥青质，然后用硅胶-氧化铝柱色层分离出饱和烃、芳烃和非烃。

饱和烃色质分析用TRACE GC ULTRA色谱仪，连接Thermo DSQII质谱仪，使用30 m长、HP-5型、直径0.25 mm、膜厚0.25μm的毛细管柱。He作为载气，1 cm3/min恒流。程序升温：50℃恒温5 min；50～220℃，4℃/min；220～320℃，2.0℃/min；320℃恒温25 min，气化室温度300℃。

2 结果与讨论

对空白对照样M0接种SLTHX114株的M1、接种SLTHX214株，并加入微生物营养液的M3以及接种SLTHX214株的M4模拟样品进行第4周降解气组分、第4周及第8周原油族组分以及相关生标化合物变化特征分析。

2.1 降解气组分变化特征

微生物在对原油降解过程中常伴随着CO2的产生[16]。本模拟实验中，随着降解时间的增加，第4周取得模拟气样组分特征如图2所示。接种两种原油降解菌SLTHX114株和SLTHX214株的模拟实验过程中所产生的降解气CO2含量均较高(18.26%～90.51%)。对比两种原油降解菌模拟实验降解气组分差异，发现接种SLTHX214株的M3和M4降解气中CO2表现出高异常现象(分别为87.36%和90.51%)，而烃类组分相对较低。而接种SLTHX114株的M1中CO2含量(18.26%)远低于接种SLTHX214株的气样，而烃类组分(C2～C5)含量相对较高，表明菌株SLTHX214对原油的降解能力相对更强。

注：M1为接种勿色杆菌并加入微生物营养液；M3为接种黄色假单胞菌并加入微生物营养液；M4为接种黄色假单胞菌；M0为空白对照样。图2 两种原油降解菌模拟实验降解气组分对比

2.2 原油族组分变化特征

微生物降解原油各组分的难易程度一般为：饱和烃>芳烃>胶质和沥青质，其中芳烃具有数量庞大、结构独特、机理复杂等特征[17-18]，且其溶解性强，迁移能力高，会对土壤及地下水造成较大危害[19]。

通过模拟实验第4周和第8周降解原油与原始油样族组分对比分析见图3，降解原油中芳烃组分明显降低，饱和烃、非烃和沥青质含量相对增加，其中饱和烃含量变化较非烃和沥青质小，表明两种原油降解菌对原油中饱和烃和芳烃均有降解，但芳烃组分降解具有相对优势。对比两种降解菌在模拟第4周降解原油的族组分含量差异，M3和M4样品中芳烃组分含量(分别为17.8%和13.8%)低于M1(20.3%)，而饱和烃含量较高，表明菌株SLTHX214对芳烃的降解强度和速率可能高于菌株SLTHX114，体现出不同菌株对原油的降解作用具有速度效应。随着降解时间的增加，第8周测得的3个模拟油样的各族组分含量趋于稳定，菌株SLTHX114对原油的降解程度达到与菌株SLTHX214相同的效果。对比不同降解时间M3和M4原油族组分的变化特征，第4周M4样品中芳烃组分含量明显低于M3，至第8周两者各组分趋于相同，表明营养液对微生物降解原油启动有协助作用，随着降解时间的增加，降解速率趋于稳定。

注：M0为原始油样；M1为接种勿色杆菌加入微生物营养液；M3为接种黄色假单胞菌并加入微生物营养液；M4为接种黄色假单胞菌；M1-2、M3-2和M4-2为降解第8周原油。图3 两种原油降解菌模拟实验第4周和第8周降解油族组分对比

2.3 生物标志化合物评价原油降解程度

生物标志化合物是原油中相对较难被微生物降解的一类化合物，因不同化合物对微生物降解的敏感性存在差异，因此常被用来评价原油微生物降解程度。本文对饱和烃主要生物标志物——正构烷烃、类异戊二烯烃和萜类化合物进行了对比分析。

通过对原始油样及生物降解原油的生物标志化合物参数对比见表1，接种两种菌株的降解原油生标参数Pr/nC17、Ph/nC18和(Pr+Ph)/(nC17+nC18)较原始样品明显增大，表明正构烷烃已被微生物降解至一定阈值，并开始与类异戊二烯烃同时被消耗。降解原油中Pr/Ph比值远小于未降解油，表明姥鲛烷对生物降解作用较植烷更敏感，降解速率更大，这与文献报道一致[20]。两种菌株对原油降解的不同阶段，上述参数均未表现出明显差异。但通过比值参数C30αβH/(Pr+Ph)变化特征来看，随着降解时间增大，该参数表现出显著增大的特征，且在两种菌株之间也表现出较大的差异。接种菌株SLTHX114的降解油样该参数在降解不同阶段均相应的高于接种菌株SLTHX214的降解油样，表明菌株SLTHX114对饱和烃降解更具优势，且两种菌株对原油的降解等级已达到4级降解。

表1 不同原油降解菌不同时间降解原油中主要生物标志参数对比

另外，与前人研究成果相反的是，两种菌株降解原油的伽马蜡烷指数及Ts/Tm参数随生物降解而表现出降低的趋势。因此，在严重生物降解原油油源对比，沉积环境分析及成熟度评价时，上述参数均不可用。

3 结 论

综上所述，革兰氏阴性的黄色假单胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214对原油的降解能力和效率强于革兰氏阳性的勿色杆属菌种(Achromobatersp)SLTHX114。两种原油降解菌均优先降解原油中芳烃组分，黄色假单胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214对芳烃的降解能力相对高于勿色杆属菌种(Achromobatersp)SLTHX114，而勿色杆属菌种(Achromobatersp)SLTHX114对原油中饱和烃组分的降解能力相对强于黄色假单胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214，不同菌种对原油不同组分具有选择性和互补性。自然生态环境中，G+和G-不是单独存在的，其合理菌群的构建，可为原油烃类污染土壤的微生物修复提供理论依据与技术参考。对上述两种原油降解菌的降解机理和土壤降解效率还在进一步研究中。