ARTP诱变技术选育高产谷氨酰胺酶的曲霉菌种

周其洋，张书泰

(佛山市海天(高明)调味食品股份有限公司，广东 佛山 528500)

谷氨酸是酱油等调味食品中最关键的呈味物质之一，是衡量酱油质量的重要指标之一[1,2]。酱油酿造原料中含有40%～50%的谷氨酰胺，如果能够将其转化为谷氨酸，不仅能提升原料的利用率，而且是酿造天然高品质原油的技术支撑[3]。在酱油酿造过程中，米曲霉所产的谷氨酰胺酶是将谷氨酰胺水解为谷氨酸最重要的关键酶[4,5]。

与添加外源谷氨酰胺酶产品相比，通过菌种诱变选育高产谷氨酰胺酶的米曲霉，既提高了酱油的谷氨酸含量，降低了生产成本，又保证了酿造酱油的色、香、味[6-9]。传统的菌种诱变方法包括物理诱变(如紫外、60Co、N+离子注入等)和化学诱变(如EMS、亚硝基胍等)。其中物理诱变回复突变严重，且多年的诱变容易形成诱变疲劳，而化学诱变的诱变剂多具有强致癌性[10-12]。常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)生物诱变育种技术是一种新型的诱变手段，具有射流温度低，产生的等离子体均匀，无需真空装置，操作简便，成本低，与生物大分子和细胞作用明显等优点[13-17]。目前已经在提升米曲霉产曲酸和蛋白酶活力方面取得了良好效果，但尚未有利用ARTP诱变选育谷氨酰胺酶高产菌株的报道。

本研究利用刚萌发的孢子这一敏感受体，采用ARTP诱变技术进行诱变，结合平板快速筛选和96孔板高通量检测，建立了一套针对谷氨酰胺酶的米曲霉菌种高通量诱变选育方法，并通过酱油发酵验证了目标菌株在高产谷氨酸方面的突出效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 出发菌株

沪酿3.042：购自广东省微生物研究所；菌株3.811、336-2、A98和A1428：由本公司菌种保藏中心提供。

1.1.2 培养基

斜面培养基：KH2PO41 g，MgSO40.5 g，(NH4)2SO40.5 g，可溶性淀粉20 g，豆汁1000 mL，于115 ℃灭菌15 min。

平板初筛培养基：L-谷氨酰胺10 g，酵母浸膏5 g，K2HPO41 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.5 g，酚红0.015 g，于121 ℃灭菌15 min。

复筛培养基(种曲培养基)：麸皮12 g，豆粕3 g，水8 mL于250 mL容量瓶中，搅拌均匀后于121 ℃灭菌15 min。

制曲培养基：豆粕∶麸皮∶水为80∶20∶60，搅拌均匀后于121 ℃灭菌15 min。

1.1.3 试剂

L-谷氨酰胺：纯度>99%，美国西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)生产；谷氨酸检测试剂盒：德国拜发公司(R-Biopharm)生产；其他试剂：均为分析纯，采用双蒸水配制。

1.1.4 主要仪器

SKY-2102C恒温振荡摇床 上海苏坤实业有限公司；恒温培养箱(HPS-200生化培养箱) 北京东联哈尔仪器制造有限公司；LB941多功能酶标仪 德国Berthold公司；ARTP-Ⅲ诱变育种仪 思清源生物科技有限公司；台式离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；TD5M-WS多管架自动平衡离心机；Thermo Shaker微孔板恒温振荡器。

1.2 实验方法

1.2.1 出发菌株的选择

对菌株沪酿3.042、3.811、336-2、A98和A1428进行酶系及发酵性能测定，选择综合性能较好的菌株作为出发菌株。

1.2.2 孢子萌发敏感体的培育

孢子悬浮液的制备：选择成熟的斜面菌种，用孢子铲铲取一平铲孢子于装有50 mL生理盐水(另外添加了0.1%吐温80)的150 mL三角瓶中，三角瓶中装有玻璃珠，于恒温振荡摇床200 r/min振荡10 min，过G2砂芯漏斗，得孢子悬浮液，用血球计数板计数后，调整浓度为108个/mL。

萌发敏感体的培育：吸取孢子悬浮液，按10%(V/V)接种量接种到YPD培养基中，于恒温震荡摇床中160 r/min，30 ℃培养4 h，使得孢子刚刚萌发，用G3砂芯漏斗过滤去除未萌发的孢子，截留萌发的孢子，用生理盐水洗下，重悬，用血球计数板计数后，调整浓度为107个/mL，获得萌发敏感体菌悬液，备用。

1.2.3 ARTP诱变时间的确定

选择不同的诱变处理时间(20，40，60，80，100，110，120，140，160 s)，在功率120 W、气流量10 L/min的条件下，对萌发敏感体进行ARTP诱变，以未经诱变的菌悬液为对照，涂布平板，计算致死率。

1.2.4 诱变菌株平板初筛

孢子萌发敏感体经ARTP诱变后，将孢子液进行适当稀释，进行涂布，于30 ℃培养。在平板培养基上，挑选生长速度快、红色变色圈大的菌落，接种试管斜面，确定为初筛菌株。

1.2.5 诱变菌株制曲复筛

将初筛菌株进行小规模制曲发酵，检测成曲的孢子数、中性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、糖化酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶活力。其中，孢子数的检测方法参照文志州的方法；中性蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶活力的检测方法参照李荔等的方法；纤维素酶、果胶酶、糖化酶的检测方法参照谭永水等的方法[18-20]。

1.2.6 诱变菌株快速发酵

采用高盐稀态发酵法，于30 ℃发酵20 d。发酵醪汁过滤，取滤液检测发酵原油的总酸、氨基氮、谷氨酸指标。筛选综合性能优异的菌株，确定为复筛菌株。

1.2.6.1 总酸、氨基氮的测定

总酸和氨基氮的检测参照李荔等的方法。

1.2.6.2 L-谷氨酸的测定

L-谷氨酸采用德国拜发公司(R-Biopharm)的谷氨酸检测试剂盒进行检测。

1.2.7 原油氨基酸分析

过滤酱渣，取过滤的酱油测得游离氨基酸。测定过程委托中广测进行测定。

2 结果与分析

2.1 出发菌株的选择

通过制曲测定菌株沪酿3.042、3.811、336-2、A98和A1428的孢子数、中性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、糖化酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶的活力；通过快速酱油发酵测定其总酸、氨基氮、谷氨酸等指标，结果见表1。

表1 出发菌株主要指标检测结果

由表1可知，菌株A1428综合酶活力和酱油发酵后L-谷氨酸含量相对较高。因此，以菌株A1428为出发菌株进行ARTP诱变，选育高产谷氨酰胺酶活力的菌株。

2.2 ARTP诱变时间的确定

将菌株A1428孢子悬浮液适当稀释后，取10 μL在诱变育种仪上进行诱变，设定功率为120 W，气流量为10 L/min。诱变时间为20，40，60，80，100，110，120，140，160 s，以0 s作为对照，诱变结束后用生理盐水洗涤垫片，适当稀释后取100 μL涂布，于30 ℃培养72 h，计算诱变致死率，见图1。

图1 ARTP致死率曲线图

由图1可知，随着诱变处理时间的延长，曲霉致死率逐渐上升。当诱变处理时间为40～100 s时，曲霉致死率变化较小，均在80%左右。诱变时间增加至120～140 s时，致死率达到90%～95%；当处理时间达到160 s时，曲霉致死率达到100%。为了获得较高正突变率和较高高产谷氨酰胺酶活力的菌株，本试验将致死率设定在90%以上。因此，选择120 s作为ARTP的诱变处理时间。

2.3 诱变菌株初筛平板

菌株A1428孢子萌发敏感体经ARTP诱变后，在平板培养基上筛选得到5株生长快、颜色变化快、色泽深的菌落作为初筛菌株，见图2。

图2 诱变菌株平板初筛

2.4 诱变菌株小试复筛分析

将初筛得到的诱变菌株酶活力和发酵进行小试复筛。选择酱油制曲中菌株孢子数、中性蛋白酶活力、淀粉酶活力和谷氨酰胺酶活力评价初筛菌株酶活力。以发酵后原油总酸、氨基氮和L-谷氨酸含量评价菌株发酵性能，结果见表2。

表2 诱变菌株制曲指标测定结果

由表2可知，制曲阶段诱变菌株A17的孢子数仅为59亿个/g，不适于工业生产应用。诱变菌株A235的中性蛋白酶活力太低，不利于曲料中蛋白质水解和原料利用。诱变菌株A103、A380和A457中，菌株A380的综合酶活力较高，孢子数适宜。其中，诱变菌株A380制曲阶段谷氨酰胺酶活力最高，发酵阶段氨基氮含量和L-谷氨酸含量较高。

2.5 菌株发酵原油氨基酸比较

发酵结束后，过滤酱渣，取过滤的酱油测得游离氨基酸，比较菌株A1428及诱变菌株A380发酵原油中16种氨基酸分布，结果见表3。

表3 原油游离氨基酸含量比较

续 表

由表3可知，2株菌株发酵原油16种氨基酸中谷氨酸含量占比最高，菌株A380的游离氨基酸总量高于A1428。其中，菌株A380原油鲜味氨基酸Glu和Asp较菌株A1428高，这可能与菌株谷氨酰胺酶活力存在差异有关；菌株A380和A1428原油甜味氨基酸(Thr、Ser、Pro、Gly、Ala)所占比例分别为32%和37%；菌株A380和A1428原油苦味氨基酸(Met、Ile、Leu、Phe、His、Lys、Arg)所占比例分别为35%和26%[21,22]。氨基酸含量是酱油风味的一个重要指标，菌株A380原油中鲜味氨基酸、甜味氨基酸较出发菌株A1428都有一定的提升，苦味氨基酸相对较低，具有一定的应用价值。

3 结论

本文以综合性能优良的酱油生产曲霉菌株A1428为出发菌株，利用ARTP作为诱变方法，最佳诱变条件为：功率120 W，气流量10 L/min，诱变时间120 s。经平板初筛和酱油制曲、发酵复筛，结合96孔板法建立高通量筛选诱变菌株的方法，得到一株高产谷氨酰胺酶菌株A380。该菌株谷氨酰胺酶活力较出发菌株高25%，发酵原油谷氨酸含量提高了20%。比较出发菌株和诱变菌株A380发酵原油氨基酸分布，发现菌株A380原油中鲜味氨基酸、甜味氨基酸较出发菌株A1428都有一定的提升，苦味氨基酸相对较低。

诱变菌株A380的中性蛋白酶和淀粉酶相比出发菌株都有一定的提升，对原料中蛋白质等大分子的分解、转化都有重要的作用。下一步可扩大试验规模，继续研究诱变菌株A380的稳定性、抗杂菌能力，以及氨基氮生产率、谷氨酸生成率、全氮水解率和原料利用率等经济指标，为工业化生产奠定基础。