几种醋酸菌混合发酵对果醋品质的影响研究

郑显义

(内江职业技术学院，四川 内江 641000)

果醋是以水果或果品加工下脚料为原料，经发酵酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸性调味品[1]。果醋不但味美香浓，而且营养丰富，具有一定的保健功能。果醋中含有大量的有机酸、维生素、矿物质等营养成分，还有人体必需的氨基酸，它能够在一定程度上缓解疲劳、开胃消食、解酒保肝、抗菌消炎、调节酸碱平衡，还有研究表明果醋可以降低血脂和胆固醇，预防动脉硬化和心脑血管疾病的发生[2]。

在国内，目前还没有针对果醋的专门酵母菌，而且酿造果醋使用的菌种比较单一，这会大大影响产品的风味，产品质量也不稳定[3-5]。而多菌共酵可以有效改善产品的风味，提高产品的稳定性[6]。实验研究表明，从自然发酵的酒糟或果酒液中分离、出来的酵母菌菌种检出率较高，因其生长环境与酿酒环境相似[7]。因此，本实验从草莓表皮及果肉中分离、筛选出优良的醋酸菌株，并与工业上常用的菌株共酵[8,9]，并对发酵的最佳条件进行摸索，进行果醋酿造。

1 材料与方法

1.1 材料

草莓、PDA培养基、YEPD培养基：市售。

1.2 设备

SHL207型ACA榨汁机 北美电器(四川)有限公司；SPX-250B型生化培养箱 四川飞利浦家用电器有限公司；SZH-B型水浴恒温振荡器、KDZX-40B型全立式自动控温高压灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SPX-250B型生化培养箱 上海跃进医疗器械厂；pH计 德国赛多利斯股份有限公司；CKX31-A12PHP型显微镜 日本奥林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 草莓中酵母菌的筛选[10-13]

将市售草莓用无菌水简单清洗，取样品10 g，捣碎后用无菌水依次稀释至10-1～10-6，振荡培养10 min，吸取 0.1 mL上清液于PDA培养基中，28 ℃培养 48 h，之后在培养基上选择具有酵母菌典型菌落特征的菌落进行划线分离并镜检分纯，直至显微镜观察为纯菌落。将分纯的菌落移植在PDA斜面上培养28 ℃后，于4 ℃保存。将分离到的菌株进行YEPD斜面活化，培养10 h后，以10%的量接种到含糖20%的YEPD培养液中，于振荡培养箱中30 ℃培养7 d，通过感官比较选出酒味浓郁并有特征香味的菌株。将菌种活化扩大培养后，再用10%的接种量接种到10 mL的YEPD液体试管培养基中，然后放入杜氏管。在培养箱中于30 ℃静置培养，每12 h观察一次产气情况，并记录气泡高度。根据实验结果，筛选出发酵快、性能好、生长旺盛的菌株。

1.3.2 草莓中酵母菌的性能测试

1.3.2.1 温度耐受性

选择糖度为18 °Bx的培养液，摇床转速为90 r/min，将上一阶段筛选出来的酵母菌以10%的接种量，分别接种在25，30，35 ℃温度条件下培养5 d，每隔24 h取样蒸馏测发酵酒度。

1.3.2.2 产酸速度[14,15]

按10%的接种量将菌种接入酒精含量为12%的生长培养基中，于30 ℃条件下恒温静置培养，每天测定发酵液的醋酸含量，当醋酸含量保持恒定时结束发酵。

1.3.2.3 SO2耐受性试验[16]

向草莓汁中添加亚硫酸钠，使培养液中SO2的浓度达到60，90，120，150，180，210 mg/L，糖度为18 °Bx，摇床转速为90 r/min，以10%的接种量于30 ℃培养5 d，每天固定时间取样蒸馏测发酵酒度。

1.3.2.4 酒精度耐受性[17]

以10%的接种量将菌种加入酒精含量为6%、8%、10%、12%、14%的生长培养基，摇床转速为90 r/min，30 ℃培养72 h，在400 nm波长处测OD值。

1.3.3 多菌发酵试验设计

1.3.3.1 发酵菌株选择

将发酵菌种分为A，B，C 3组，每组的菌种组成如下：A(工业上常用的食醋发酵醋酸菌AS1.41和沪酿1.01)；B(草莓中筛选出来的优质醋酸菌株ST-03和ST-11-1)；C(将A，B 2组共4株菌株混合，即食醋发酵醋酸菌AS1.41、沪酿1.01、ST-03和ST-11-1)。

在榨好的草莓汁中分别加入经过活化的固定化醋酸菌A，B和C，接种量均为10%，进行醋酸发酵。发酵过程中，控制初始发酵温度为30～35 ℃，空气流量比为1∶0.2，摇床转速为90 r/min；中期旺盛期温度为38～40 ℃，空气流量比为1∶0.4，摇床转速为120 r/min；发酵后期为防止乙酸进一步氧化，将温度降为35 ℃，空气流量比为1∶0.2，发酵时间为2 d, 每24 h测定发酵液中酸度，当酸度不再上升时终止发酵。发酵好的草莓醋经过滤后, 调整酸度为5%～6%，95 ℃杀菌5 min后即为成品[18,19]。

1.3.3.2 发酵的最佳条件[20-24]

根据1.3.3.1中筛选出来的菌进行发酵工艺优化，然后进行正交试验，确定最佳发酵条件，正交试验设计见表1。

表1 草莓果醋发酵条件正交试验设计

1.3.3.3 感官评价

挑选15位有经验的感官分析人员，对其进行培训，并让他们对发酵所得草莓果醋的色泽、澄清度、气味和口感进行打分，每个项目的满分为25分，总分为100分。去掉最高分和最低分后取算术平均值，评分标准见表2。

表2 草莓果醋评分标准

2 结果与讨论

2.1 草莓中醋酸菌筛选结果

通过分纯划线等操作，根据菌株的颜色、形态和产气情况等因素，筛选出两株菌，分别为ST-03和ST-11-1。现将两株菌混合，做如下性能测试。

2.1.1 温度耐受性试验结果

图1 草莓中醋酸菌温度耐受性试验

由图1可知，在25～35 ℃温度范围内，酵母菌的最佳生长温度为30 ℃。在35 ℃条件下，前3 d酒精度增长呈正常的上升趋势，从第4天开始基本停止生长，推测是较高的温度抑制了醋酸菌的酶活。在25 ℃条件下，随着温度的升高，醋酸菌的产酒精能力逐渐增强。但较低的温度会使酶活力受到抑制，因此在此温度下，醋酸菌的产酒率较低。因此，尽管在25 ℃的条件下，醋酸菌的产酒量随着培养天数的增加仍然在上升，但菌株的酶活不如30 ℃。

2.1.2 产酸速度结果

图2 草莓醋酸菌的醋酸产生速度

由图2可知，在发酵前4 d，ST-11-1的产酸速度较慢，ST-03的产酸速度相对较快，而将两者混合的产酸速度与ST-03单菌的产酸速度相差不多。从第5天开始，两株菌的醋酸产量差距逐渐缩小，到第6天与第7天几乎已经重合，但两株菌混合的效果仍然稍微高一些。综上，将两株菌混合，即ST-03和ST-11-1组合的产酸能力最佳。

2.1.3 SO2耐受性试验结果

图3 草莓醋酸菌的SO2耐受性

由图3可知，随着SO2添加量的增加，酒精产率逐渐降低，但影响不大，只是略微下降，说明草莓中筛选出的两株醋酸菌对SO2具有较好的耐受性。从草莓果醋的颜色来看，随着 SO2添加量的增加，果醋由开始的暗红色逐渐变淡，说明SO2的量增多，漂白效果逐渐显现。虽然两株菌有一定的SO2耐受性，但控制SO2的量在90 mg/L以下较好。

2.1.4 酒精度耐受性

图4 草莓醋酸菌的酒精度耐受性

由图4可知，酒精含量为6%时已经对草莓醋酸菌产生抑制作用，并且这种抑制作用随着酒精含量的增加而增加，酒精含量达到10%时基本已经达到酵母菌的耐受极限。酒精虽然是醋酸菌发酵过程中的产物，但对于细胞本身来说会抑制醋酸菌的生长。因此在发酵过程中，建议将酒精度控制在6%以下。

2.2 发酵菌株选择结果

根据感官评分，对3种醋酸菌组合进行比较，结果见表3。

由表3可知，总评分最高的是C组，即：将食醋发酵醋酸菌AS1.41、沪酿1.01、ST-03和ST-11-1混合发酵的效果最佳。因此，在下一步实验中，将4种菌株混合，探究发酵的最佳条件。

表3 不同醋酸菌发酵感官评价表

2.3 发酵最佳条件

根据正交表的设计，结合感官评分表，对草莓果醋的最佳发酵条件进行摸索，得到的结果见表4。

表4 不同发酵条件感官评价表

由表4可知，以感官评分为衡量指标，在多菌共酵过程中，影响发酵质量的主次因素顺序为A>B>C，即温度>时间>接种量；其中，最优组合为A2B3C1，即发酵温度为30 ℃，发酵时间为7 d，接种量为8%。

3 结论

通过在新鲜草莓表皮及果肉中筛选，得到两株具有良好发酵潜力的醋酸菌ST-03和ST-11-1，并对两株菌的温度耐受性、产酸速度、SO2耐受性以及酒精度耐受性进行了测试。将它们与传统工业食醋发酵醋酸菌AS1.41和沪酿1.01混合进行多菌共酵制作草莓果醋，确定最佳发酵条件为发酵温度30 ℃，发酵时间7 d，接种量8%。所制作的草莓果醋具有澄清度高、风味及口感优良的特点。