葡萄致腐菌的分离及大蒜汁对其抑制效果研究

张薇，罗吉庆，江丽慧，张永杰，陈莹琪

(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 自贡 643000)

葡萄皮薄，果实含糖高，在贮运过程中易破损成为一些致腐菌的天然培养基，因此葡萄采后腐烂是葡萄产业发展的一个重要障碍。葡萄果实采后病害防治主要采用SO2熏蒸、低温冷藏和气调贮藏的方法[1，2]，但其技术要求和操作成本均较高，且大量使用化学杀菌剂会使致病菌产生抗药性,对人体健康及环境也会造成危害。因此，开发一种安全、有效的天然杀菌剂用于葡萄采后病害防治具有巨大应用前景。

天然植物杀菌剂具有低毒、环境友好等特点[3-5]。大蒜对多种病原微生物及肿瘤都有不同程度的抑制或杀灭作用[6-8]。对大蒜汁液的直接应用研究较少且集中于对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等细菌[9-12]的抑制效果研究，关于大蒜汁对葡萄采后病害的防治研究鲜有报道[13,14]。本文结合葡萄贮藏防腐和大蒜汁推广应用的实际情况，对新鲜大蒜汁和放置12 d的陈大蒜汁在不同浓度下对葡萄主要致腐真菌的抑制效果进行了研究[15]。使大蒜汁在葡萄防腐的推广应用中有了更大的优势，对大蒜的进一步开发利用具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料

白皮大蒜、巨峰葡萄、马奶葡萄、马铃薯。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)、改良PDA培养基(加20%葡萄汁)：自制。

1.2 试验方法

1.2.1 感病、健康组织病原菌分离及形态学鉴定

采用组织块分离法对感病组织病原菌进行分离，选取不同腐烂病状的果实或果梗，用75%的消毒酒精进行表面消毒，在病健交界处切取植物组织1 cm2植入改良的PDA培养基中，置于28 ℃恒温培养2～3 d,至菌落直径为1 cm时，挑取菌落边缘少量菌丝植入另一PDA培养基中培养，重复上述操作3～5次即可作为纯化菌种备用，进行3批分离。

采用平板涂布法对健康组织病原菌进行分离，选取10个健康果粒或果梗放入75%的消毒酒精中浸泡30 s，吸除酒精后，移入1%的次氯酸钠溶液中浸泡1 min，再用灭菌水清洗3次(本操作在灭过菌的培养皿中进行)，最后用灭菌纸吸干，放入研钵中研磨，果梗部位研磨时加入少量无菌水，最后在改良的PDA培养基上涂平板，果粒和果梗分别涂3个平板，进行3批分离。置于28 ℃恒温培养箱中培养2～3 d，出现单个针尖大小的小菌落时迅速植入另一PDA培养基中进行纯化。纯化2～3次以后即可得到纯菌种，备用。

将分离的致腐菌株回接到被分离的寄主果实或果梗上以后，若发病症状与贮运中腐败症状相符，就可作为采后病害病原菌进一步鉴定到属。根据各致腐菌株在PDA培养基上的菌落特征，水浸片中分生孢子及分生孢子梗的形态特征，参照相关真菌鉴定手册进行鉴定[16]。

1.2.2 孢子悬液的制备

把得到的致腐菌接种在改良PDA培养基平板上培养7 d进行菌种活化。将活化后的菌种制成菌悬液,于调速多用振荡器振荡30 min,镜检计数，然后用无菌水稀释若干倍，配成适宜浓度(控制浓度为105～106spore/mL)的孢子悬液,待用。

1.2.3 大蒜汁的制备

称取去皮大蒜50 g，捣碎，在38 ℃下酶解20 min，采用1∶1 (g/mL)的料液比加入无菌水，再于离心机中3000 r/min离心20 min，取上清液作为100%的大蒜汁，按二倍稀释法用适量无菌水稀释为50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%的大蒜稀释液，混匀后备用。以当日制备的新鲜大蒜汁为A组，28 ℃避光存放至第12天的大蒜汁作为陈大蒜，为B组。

1.2.4 致腐菌的体外熏蒸和直接接触试验

将定性滤纸剪成直径为6 mm大小的圆形纸片，封装于培养皿中，于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,备用。

体外熏蒸试验参考冯武的滤纸片法[17]。用无菌打孔器在培养7 d的致腐真菌平板上取直径为 6 mm 的菌块放入新制的PDA平板中央，将平板倒置。

直接接触试验参考邓芳席等的抑制圈法[18]。将已灭菌冷却至约50 ℃的PDA培养基倒入培养皿，待其凝固。编号后吸取待测致腐菌孢子悬液100 μL于培养基表面，涂布均匀，放入28 ℃恒温培养箱中10 min使孢子附着在平板上。以上两种试验再用无菌镊子夹取已经灭过菌且在各稀释度大蒜汁中浸泡过并沥干的无菌圆形滤纸片贴在固体平板盖中央，新鲜大蒜汁A组与陈大蒜汁B组各重复3次，以滤纸片上为无菌水的平板为对照，迅速用保鲜膜密封，于28 ℃培养2～5 d后观察菌落生长情况。

体外熏蒸试验用十字交叉法测量菌落生长直径，由下式计算出抑制率：

抑制率(%)=(C-T)/C×100。

式中：C为对照菌落直径(cm)；T为不同浓度条件下菌落直径(cm)。

直接接触试验用十字交叉法测量抑菌圈直径，抑菌效果的判定标准见表1。

表1 抑菌效果的判定标准

1.2.5 最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定

将5 mL各稀释度(由低到高)的大蒜汁和5 mL作为对照的无菌水分别加入到7个装有15 mL已灭菌冷却至50 ℃的PDA 培养基的培养皿中，混合均匀，待其凝固。编号后吸取待测致腐菌孢子悬液100 μL于培养基表面，涂布均匀，置于 28 ℃下培养 5 d，观察有无菌落生长，若有记为阳性(+)，表明该稀释度大蒜汁无抑制作用；若无记为阴性(-)，以完全没有菌生长的最低浓度作为该大蒜汁的MIC。将完全没有菌生长的平皿继续培养4 d若仍不长菌，则为MBC，重复3次。

2 结果与讨论

2.1 致腐菌的分离纯化及形态学鉴定

通过对2种葡萄的病原菌进行分离，一共得到6种真菌，但只有4种返接到葡萄上能致病。在显微镜下，对这些致病菌的形态学鉴定如下：

K-1 菌落表面菌丝初期为白色，成熟后为浅灰色，肉眼可见菌丝顶部的土灰色孢子囊，菌丝层较厚，基内菌丝呈黑色，菌丝生长较慢，显微镜下可见其分生孢子梗顶端膨大，上生有小突起，分生孢子单生于小突起上，呈球形或亚球形，鉴定为灰霉菌见图1。

图1 葡萄致腐菌K-1的分生孢子(a)和分生孢子梗(b) 显微镜图(×400)

K-2 菌落表面菌丝初期为白色，后转为灰黑色，产生黑色颗粒状孢囊，基内菌丝呈黄色，可见有规则的放射状，显微镜下可见其分生孢子头顶囊呈球形或近球形，表面生两层小梗，放射状排列，成熟的分生孢子呈球形，鉴定为黑曲霉(见图2)。

图2 葡萄致腐菌K-2的分生孢子(a)和分生孢子梗(b) 显微镜图(×400)

K-3 菌落表面呈青绿色粉末状，有白色边缘，基内菌丝成熟后为黄色，生长速度较慢，显微镜下可见其分生孢子梗呈帚状分枝，顶端产生许多瓶梗，瓶梗上着生有分生孢子链，分生孢子呈球形或卵圆形，鉴定为青霉属菌(见图3)。

图3 葡萄致腐菌K-3的分生孢子(a)和分生孢子梗(b) 显微镜图(×400)

K-4 菌落初期为白色，气生菌丝发达，生长速度极快，1～2 d内菌丝可迅速蔓延至整个平板，生长后期的气生菌丝转为淡褐色，菌丝层上部有黑色颗粒状物出现，培养基背面呈褐色，显微镜下可见其直立孢囊梗下的假根，匍匐菌丝呈弓状弯曲，孢子囊呈球形或椭圆形，孢子呈球形或椭圆形，鉴定为根霉属(见图4)。

图4 葡萄致腐菌K-4的假根、孢子囊(a)和孢囊梗(b) 显微镜图(×400)

2.2 致腐菌反接到葡萄上

本实验中，主要分离葡萄致腐真菌，共分离得到6种真菌，其中4种返接马奶葡萄果粒(见图5)和巨峰葡萄果粒(见图6)后，可引起并加速马奶葡萄和巨峰葡萄果粒或果梗腐烂，其余2种返接后均不引起腐败。结果表明，在返接培养10 d后，与不接菌的对照相比，在马奶葡萄上，灰霉比其他3种引起更加严重的症状(见图5)。在返接培养10 d后，巨峰葡萄上对照也已开始腐烂，表明巨峰葡萄本身比马奶葡萄更不耐保藏，且与对照相比，根霉引起症状更加明显，青霉次之，然后是灰霉和黑曲霉(见图6)。

图5 马奶葡萄的腐败情况

图6 巨峰葡萄的腐败情况

2.3 4种致腐菌的体外熏蒸试验和直接接触试验

按照1.2.1中的体外熏蒸试验和直接接触试验方法进行操作，A组中不同浓度大蒜汁对灰霉、黑曲霉、青霉和根霉熏蒸后的抑制率和直接接触后的抑菌效果见图7、图8和表2。

图7 4种致腐菌的体外熏蒸试验——A组

图8 4种致腐菌的直接接触试验——A组

大蒜汁浓度(%)体外熏蒸抑制率(%)/直接接触抑菌敏感度灰霉黑曲霉青霉根霉10031.1高55.6高38.4 高31.8高5019.3高52.6高30.1 高30.6高2517.8中43.0高23.9 中28.7中12.516.2中37.3高20.8 中28.3中6.2512.2中33.9中16.7 中21.7低3.138.3低27.9中10.5 低7.5低00.0不敏感0.0不敏感0.0 不敏感 0.0不敏感

由表2可知，A组的大蒜汁浓度越大，对4种致腐菌的抑菌效果越好，敏感度越高，100%和50%浓度的大蒜汁对4种致腐菌均为高度敏感抑菌效果；大蒜汁在相同浓度条件下，对黑曲霉的熏蒸抑制作用最强，25%和12.5%浓度的大蒜汁仅对黑曲霉有高度敏感抑菌效果，对青霉、灰霉和根霉均为中度敏感抑菌效果；3.13%浓度的大蒜汁对黑曲霉的抑制率高达27.9%，与25%浓度的大蒜汁对青霉和根霉的抑制率相差无几，对黑曲霉为中度敏感抑菌效果，对青霉、灰霉和根霉均为低度敏感抑菌效果；6.25%浓度以上的大蒜汁对根霉的抑制效果差距较小，抑制率在25%左右，对根霉为低度敏感抑菌效果，对灰霉、黑曲霉和青霉均为中度敏感抑菌效果；12.5%浓度以下的大蒜汁对灰霉和青霉的熏蒸抑制作用大致相当，12.5%浓度以上的大蒜汁对青霉的抑制作用较灰霉更强。由表2可知，黑曲霉的抑菌效果最强，灰霉最弱。

最顶端的对照为对照水对菌的作用，其他6个平板为相应大蒜汁对菌的抑制效果。

B组中不同浓度大蒜汁对灰霉、黑曲霉、青霉和根霉熏蒸后的抑制率和直接接触后的抑菌效果见图9、图10和表3。

图9 4种致腐菌的体外熏蒸试验——B组

图10 4种致腐菌的体外熏蒸试验——B组

大蒜汁浓度(%)体外熏蒸抑制率(%)/直接接触抑菌敏感度灰霉黑曲霉青霉根霉10023.3 中34.6 高26.1中24.9中5018.2 中31.7 中23.9中18.5中2515.7 中29.2 中16.5 中11.9低12.510.5 低23.4 中14.3 低7.7低6.253.1 低16.9 中12.1 低4.9低3.131.0 低12.8 低9.3 低0.1不敏感00.0不敏感0.0 不敏感0.0 不敏感0.0不敏感

由表3可知，B组中大蒜汁对4种致腐菌的抑制作用均弱于A组，且对同一菌种的抑菌圈直径也小于A组，但仍都符合A组中大蒜汁浓度越大抑菌效果越好的规律。B组中100%浓度的大蒜汁仅对黑曲霉的抑制率超过了30%和有高度敏感抑菌效果，大蒜汁在相同浓度条件下对黑曲霉的熏蒸抑制作用最强，其次是青霉，100%浓度的大蒜汁对青霉、灰霉和根霉均为中度敏感抑菌效果；50%浓度大蒜汁对4种致腐菌均为中度敏感抑菌效果，25%浓度大蒜汁对青霉、灰霉和黑曲霉均为中度敏感抑菌效果，但对根霉为低度敏感抑菌效果，对灰霉和根霉几乎无抑菌作用；3.13%浓度的大蒜汁对黑曲霉的抑制率达到12.8%，对灰霉和根霉没有抑菌效果，但对青霉仍有低敏感抑菌效果。总之，12.5%浓度以上的大蒜汁对灰霉的抑制作用较明显，25%浓度以上的大蒜汁对根霉的抑制作用较明显；12.5%和6.25%浓度的大蒜汁仅对黑曲霉为中度敏感抑菌效果，对灰霉、青霉和根霉均为低度敏感抑菌效果。由表3可知，黑曲霉的抑菌效果最强，青霉、根霉、灰霉依次降低。

最顶端的对照为对照水对菌的作用，其他6个平板为相应大蒜汁对菌的抑制效果。

2.4 大蒜汁对4种致病菌的MIC和MBC

A组和B组大蒜汁对灰霉、黑曲霉、青霉和根霉的MIC(最小抑菌浓度)和MBC(最小杀菌浓度)的结果见表4和表5。

表4 A组大蒜汁对4种致腐菌的MIC和MBC

注：“+”(阳性)表示无抑制作用；“-”(阴性)表示有抑制作用。

由表4可知，A组大蒜汁对灰霉的杀菌和抑菌作用均较好，MIC和MBC均为12.5%；对黑曲霉的杀菌和抑菌作用都较好，尤其是抑菌作用，MIC和MBC分别为6.25%和12.5%；对青霉的抑制作用较好，但杀菌效果较差，MIC和MBC分别为6.25%和25%；对根霉的杀菌作用一般，MIC和MBC分别为12.5%和25%。

表5 B组大蒜汁对4种致腐菌的MIC和MBC

注：“+”(阳性)表示无抑制作用；“-”(阴性)表示有抑制作用。

由表5可知，B组陈大蒜汁对4种致腐菌的MIC和MBC均较高。对灰霉和根霉的抑制作用较差，50%浓度以下的大蒜汁平板均有菌落出现，MIC和MBC均高达50%；对黑曲霉的杀菌作用相比于其他3种菌要好，MIC和MBC均为12.5%；对青霉的抑制作用较好但杀菌作用不强，MIC和MBC分别为12.5%和25%。

3 结论

相同情况下，高浓度的大蒜汁比低浓度的大蒜汁抑菌率高，这可能与大蒜汁中的有效抑菌成分高低相关。陈大蒜比新鲜大蒜汁的抑菌效果差很多，但仍有较弱的抑菌效果且其在低浓度下直接接触抑菌的效果明显不如新鲜的大蒜汁，对根霉的抑制效果表现最差，25%浓度的大蒜汁存放12 d对根霉的抑菌效果仅为低度敏感，3.13%浓度的陈大蒜汁对根霉为不敏感抑菌效果，与空白组相同，这可能与大蒜汁中的抑菌成分分解有关。

大蒜汁的新鲜度对灰霉和根霉的抑制作用影响较大。陈大蒜汁对灰霉和根霉的MIC和MBC均高达50%，其对青霉和黑曲霉的MIC和MBC也均较新鲜的大蒜汁高。新鲜大蒜汁对灰霉的杀菌作用较好，MIC和MBC均为12.5%；对黑曲霉的抑制作用较好，MIC和MBC分别为6.25%和12.5%。新鲜大蒜汁在抑菌方面整体表现更好，对黑曲霉和根霉有较高的抑制率，在实际应用中可优先选用此方法防治葡萄曲霉病。考虑到其天然、无副作用的性能，其应用前景可观。