产乌头碱具有抑菌活性内生真菌发酵条件的优化及稳定性检测

玛依拉·吐尔地别克

摘 要：试验研究了产乌头碱具有抑菌活性内生真菌的最佳发酵条件，如温度、pH值、时间。分别将培养温度设为24 ℃、28 ℃、32 ℃，pH值为6、7、8，培养时间为5 d和7 d，采用纸片法测量抑菌圈的大小。pH值为6，时间为7 d，温度为24 ℃、28 ℃、32 ℃。由抗菌活性大小分析得出，YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3株菌株在温度为24 ℃时的抑菌圈最大，因此具有抑菌活性产乌头碱内生真菌最适温度为24 ℃，pH值为6，时间为7 d，且抑菌能力较强。产乌头碱具有抑菌活性内生真菌的生物学特性包括温度和酸碱稳定性，结果如下：YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3種菌珠所产抑菌质在45 ℃时的抑菌效果最好，YLAC-20的热稳定性最弱，菌株YLAC-3和YLAC-69的热稳定性最强，且耐高温，其抑菌活性不受影响，故在内生真菌次生代谢产物中可有效利用。产乌头碱具有抑菌活性内生真菌所产抑菌物质在酸性条件下抑菌效果最好，在pH值为4～8时，YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3种菌株对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌的抑菌效果不同。由抑菌活性表可知，产乌头碱具有抑菌活性内生真菌物质耐碱性，在碱性条件下抑菌效果较强。这为提高乌头碱产量奠定了基础。因此，产乌头碱内生真菌的研究更加有意义，有待深入研究。

关键词：乌头;内生真菌;抑菌活性

文章编号：1004-7026（2019）15-0094-05         中国图书分类号：Q946         文献标志码：A

植物内生真菌（Endophyte fungus）是指在健康植物中寄生的，在各种组织和器官内部或细胞间隙中完成部分或全部生活周期而不使宿主表现明显病理症状的一类真菌[1]。目前，国内外对植物内生真菌的研究报告较多，由此可以发现许多植物中的天然化合物与植物内生真菌有密切关系，甚至是内生真菌的次生代谢产物。近年来，国内外学者陆续发现植物内生真菌能产生抗癌物质，为解决抗癌药物的供应问题开辟了一条新的道路。

乌头是毛茛科（RanuncμLaceae）中的一类重要植物，物种极为丰富，全球约有350种，分布于北半球温带，主要分布于亚洲，其次为欧洲和北美洲[2]。药用植物的生长周期较长，分离提取的步骤复杂，生物资源不丰富，而植物的内生真菌生长周期短，可以产生与植物相似的次级代谢产物，因此可以利用微生物产生药用价值的次级代谢产物[3]。

在乌头植物的内生真菌中，有抗菌活性且活性高的菌株主要分布在乌头的根部，并且有3株内生真菌抗菌谱最广，它们分别是曲霉、毛壳菌属和毛霉。有研究对分离出的乌头内生真菌进行了抗菌活性筛选，其中有抗菌活性的菌株占内生真菌总菌数的35.98%，抗菌活性菌株中高活性菌株占比高达71.19%，这些结论足以表明乌头的内生真菌中有很多具有抗菌活性的菌株[4]。乌头属植物的内生菌资源非常丰富，因此对乌头属植物内生菌进行分离，并且从中筛选出具有生物活性作用的内生菌株，具有重要的意义，值得深入研究。

近年来，人们对药用植物的需求量与日俱增，药用植物资源开发利用也受到了人们的广泛关注。乌头类中药具有镇痛抗炎和抗休克的作用，可以扩张外周血管、抗氧化。对乌头研究较多的是药效、药用成分的分离提取、毒性、种植、田间管理和病虫害的防治等[5]。从上述研究结果可知，乌头的许多成分均具有抗肿瘤、抗菌和镇痛等作用，而且效果明显，具有良好的开发前景。

试验对产乌头碱具有抑菌活性内生真菌发酵温度、pH值、时间的优化进行了研究。将分别将培养温度设为24 ℃、28 ℃、32 ℃，pH值控制为6、7、8，培养时间为5 d和7 d，采用纸片法测定抑菌圈的大小。得到的结果为：pH值为6，时间为7 d，温度为24 ℃、28 ℃、32 ℃时，通过抗菌活性大小分析得出YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3株菌株的温度为24 ℃时抑菌圈最大，因此可以确定具有抑菌活性产乌头碱内生真菌处于24 ℃的环境下，pH值为6，培育时间为7 d时，抑菌能力较强。

产乌头碱具有抑菌活性内生真菌的生物学特性包括对热、酸碱稳定性的研究，结果如下。YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3种菌珠所产的抑菌质在45 ℃的环境中的抑菌效果最好，其中YLAC-20的热稳定性最弱，菌株YLAC-3和YLAC-69的热稳定性最强，其耐高温性和抑菌活性不受影响，故在内生真菌次生代谢产物中可有效利用。产乌头碱具有抑菌活性内生真菌所产抑菌物质在酸性条件下的抑菌效果最好，在pH值为4.0～8时，YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3株菌株对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌的抑制效果不同，在抑菌活性表中可知产乌头碱具有抑菌活性内生真菌物质耐碱性，在碱性条件下抑菌效果较强，这为提高产乌头碱的产量打下了基础。因此产乌头碱内生真菌的研究更加有意义，需要深入研究。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试菌株

试验所用的菌株是由伊犁师范大学微生物实验室保藏的YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69。

1.1.2  指示菌

大肠杆菌（Escherichia coli）CGMCC1.110 3株、草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC1.769、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和酵母菌CGMCC1.1103，均由伊犁师范学院生物与地理科学学院微生物实验室保存。

1.1.3  主要仪器

主要仪器有旋转蒸发仪器（德国IKA/艾卡广州仪器设备有限公司）、高速冷冻离心机HC-3018R（安徽中科中佳科学仪器有限公司）、振荡培养箱HYG-A（上海玺袁科学仪器有限公司）和超净工作台SWCJ1F（苏州市金净净化设备科技有限公司）。

1.1.4  主要试剂和培养基

牛肉膏蛋白胨培养基用于指示菌的培养，马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基和马铃薯葡萄糖液体（PDB）培养基用于真菌培养。

1.2  试验方法

1.2.1  具有抑菌活性内生真菌的活化

将实验室中已分离并纯化保存的YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69菌株具有抑菌活性产乌头碱内生真菌菌种接种于PDA固体培养基和PDB液体培养基中，在28 ℃的环境中培养，连续活化3代，储存于4 ℃的冰箱中备用。

1.2.2  指示菌的培养

将大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、金黄葡萄球菌的单菌落分别接种于100 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基，在37 ℃的环境中培养18 h，将酵母菌单菌落接种于100 mL的PDB培养基，在28 ℃的环境中培养48 h，取400 μL菌液接种于PDA培养基上，用无菌玻璃环进行涂抹，用于抑菌试验。

1.2.3  不同发酵条件对具有抑菌活性产乌头碱内生真菌生成的影响

将具有抑菌活性产乌头碱内生真菌分别接种于浓度为1 mol/L的氯化氢和氢氧化钠中，将PDB培养基的初始pH值分别调至6、7、8，在121 ℃的环境中灭菌30 min后，培养温度分别调至24 ℃、28 ℃、37 ℃，培养时间分别为5 d和7 d，离心后收集上清液，用0.22 μm的过滤器过滤除菌，用旋转蒸发仪将100 mL发酵液浓缩至1 mL，观察抑菌圈的大小。

采用纸片扩散法检测产乌头碱具有抑菌活性内生真菌发酵液对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和酵母菌的抑菌作用，具体步骤如下。将纸片放置于涂有指示菌的平板上并点入20 μL的发酵液，在28  ℃的环境中培养1～2 d，观察并测量抑菌圈的直径。

1.2.4  产乌头碱具有抑菌活性内生真菌发酵上清液的制备

将活化好的内生真菌菌株YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69接种于PDB液体培养基中，在28 ℃的环境中培养7 d后离心（4 ℃，8 000r/min，20min），取上清液，置于4 ℃的冰箱中保存备用。

1.2.5  抑菌物质的理化特性

（1）不同热处理对产乌头碱具有抑菌活性内生真菌所产抑菌物质的抑菌活性影响。倒平板：将PDA平板加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿20 mL（下层），待其凝固后，吸200 μL供试菌菌悬液置于平板表面，用涂布器将菌液涂布均匀。温度处理：分别在不同的温度（45 ℃、60 ℃、80 ℃）下，将内生真菌菌株发酵上清液处理10 min。纸片法： 将含有不同菌种发酵上清液滤纸片贴在已接种指示菌待测的平板表面上，每个菌株设置2个重复，放置37 ℃的环境中培养，测量抑菌圈的直径并记录。

（2）不同pH值对产乌头碱具有抑菌活性内生真菌所产抑菌物质的抑菌活性影响。倒平板：制备PDA平板加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿20 mL（下层），待其凝固。吸取200 μL供试菌加入平板表面，用涂布器将菌液涂布均匀。pH处理：分别用1 mol/L 的氯化氢和2 mol/L的氢氧化钠将乳酸菌菌株发酵上清液调为不同的pH值（4、5、6、7、8）。纸片法：将含有不同菌种发酵上清液滤纸片贴在已接种指示菌待测的平板表面上，每个菌株设置2个重复，放于37 ℃的环境中培养，测量抑菌圈的直径并记录。

2  结果与分析

2.1  具有抑菌活性产乌头碱内生真菌发酵液随不同pH值、时间和温度的变化情况

将培养温度设为24 ℃，pH值为6、7、8，培养时间为5 d和7 d，检测产乌头碱内生真菌分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌的抑菌活性，结果发现YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69的发酵液在pH值为6，培养时间为7 d时，抑菌圈最大，其中YLAC-3的pH为6，培养时间为7 d的抑菌效果最好，因此以上3株最适合的pH值为6，最佳培养时间为7 d，见表1。

将培养温度设为28 ℃，pH为6、7、8，培养时间为5 d和7 d，检测产乌头碱内生真菌分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌的抑菌活性，结果可知YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69的发酵液在pH为6，培养时间为7 d时抑菌圈最大，28 ℃时抑菌能力比24 ℃时抑菌效果能力弱。其中，在28 ℃的环境中，YLAC-69的pH值为6，培养时间为7 d时抑菌效果最好，因此以上3株最适合的pH值为6，最佳培养时间为7 d，见表2。

将培养温度设为32 ℃，pH为6、7、8，培养时间为5 d和7 d，检测产乌头碱内生真菌分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌的抑菌活性，結果可知YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69的发酵液在pH值为6，培养时间为7 d时抑菌圈最大，在32 ℃时没有在24 ℃和28 ℃时的抑菌效果明显。其中在32 ℃的环境中，YLAC-69的pH值为6，培养时间为7 d时抑菌效果最好，因此以上3株最适合的pH值为6，最佳培养时间为7 d，见表3。

综上所述，具有抑菌活性产乌头碱内生真菌在最适pH值与最佳时间的基础上，当温度分别为24 ℃、28 ℃、32 ℃时，通过检测对不同菌株的抑菌能力，得出产乌头碱内生真菌最适合的培养温度为24 ℃，最适pH值为6，最佳培养时间为7 d。

2.2  产乌头碱具有抑菌活性内生真菌对热处理的稳定性

产乌头碱具有抑菌活性内生真菌经过不同的温度处理时，其抑菌效果的变化为：YLAC-3所产抑菌物质在45 ℃时的抑菌效果最好，枯草芽孢杆菌抑菌圈达到11 mm，温度分别为60 ℃、80 ℃和100 ℃，10 min后效果有所降低;YLAC-20所产抑菌物质在45 ℃时的抑菌效果最好，大肠杆菌的抑菌圈为8 mm，温度为60 ℃、80 ℃和100 ℃，10 min后效果有所降低;YLAC-69 所产抑菌物质在45 ℃时的抑菌效果最好，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈达到9 mm，温度为60 ℃、80 ℃、100 ℃，10 min后效果有所降低，见表4。菌株YLAC-3和YLAC-69有最强的热稳定性，耐高温，其抑菌活性不受影响，故在内生真菌次生代谢产物中可有效利用，YLAC-20的热稳定性最弱。

2.3  产乌头碱具有抑菌活性内生真菌对pH的稳定性

产乌头碱具有抑菌活性内生真菌对不同pH的稳定性见表5。

pH值为4时，YLAC-20对大肠杆菌的抑菌效果最好，YLAC-20>YLAC-3>YLAC-69。YLAC-3对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-20。YLAC-3对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。对酵母菌的抑菌效果依次为YLAC-3、YLAC-69>YLAC-20。

pH值为5时，YLAC-3和YLAC-69对大肠杆菌的抑菌效果最好，YLAC-3、YLAC-69>YLAC-20。YLAC-3对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。YLAC-69对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC

-20。对酵母菌的抑菌效果最依次为YLAC-3、YLAC-69>YLAC-20。

pH值为6时，YLAC-69对大肠杆菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。YLAC-3对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。YLAC-69对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。YLAC-3对酵母菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。

pH值为7时，YLAC-69对大肠杆菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-20>YLAC-3。YLAC-3对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。YLAC-69对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。YLAC-69对酵母菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。

pH值为8时，YLAC-69对大肠杆菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-20>YLAC-3。YLAC-3对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。YLAC-69对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。YLAC-69对酵母菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。

因此，具有抑菌活性產乌头碱的内生真菌物质在碱性条件下的抑菌效果较强。

3  结束语

由于大部分中药含大量生物碱，是中药的活性成分，因此研究植物内生真菌，为解决天然药用植物解决资源匮乏的问题已成为有关人员的重要工作。有些观点认为，内生真菌长期生活在植物体内，在与宿主植物体长期共同进化的过程中，内生真菌与寄主植物宿主之间存在着基因的横向转移，它们之间的基因存在相互交换的现象[6]。

试验将具有抑菌活性产乌头碱内生真菌分别接种于用浓度为1 mol/L的氯化氢和氢氧化钠钠中，将PDB培养基的初始pH分别调至6、7、8，在121 ℃的环境中灭菌30 min，培养温度分别调至24 ℃、28 ℃、32 ℃，培养时间分别为5 d和7 d，离心后收集上清液，用0.22 μm的过滤器过滤除菌，用旋转蒸发仪将100 mL的发酵液浓缩至1 mL，观察抑菌圈大小。

采用纸片扩散法检测产乌头碱具有抑菌活性内生真菌发酵液对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和大肠杆菌以及酵母菌的抑菌作用，把纸片放置于涂有指示菌的平板上并点入20 μL的YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69菌株的发酵液，通过试验对温度为24 ℃、28 ℃、32 ℃，pH值为6、7、8，时间为5 d、7 d时测定抑菌圈的大小，最终确定具有抑菌活性产乌头碱内生真菌在温度为24 ℃、pH值为6、时间为7 d时的抑菌能力较强。

分析不同热处理对菌株所产抑菌物质的抑菌活性的影响发现，YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69菌珠所产抑菌质在45 ℃的抑菌效果最好，其中YLAC-20表现最弱的热稳定性，菌株YLAC-3和YLAC-69表现最强的热稳定性，菌株高温，抑菌活性不受影响，故在内生真菌次生代谢产物中可有效利用。

在产乌头碱具有抑菌活性内生真菌所产抑菌物质在酸性条件下抑菌效果最好，在pH值为4～8时，YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69菌株对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌的抑菌效果不同，产乌头碱具有抑菌活性内生真菌物质耐碱性，在碱性条件下抑菌效果较强。

从国内外研究可知，乌头的许多成分均具有抗肿瘤、抗菌和镇痛等生物学特性，且表现良好，具有很好的开发潜力。

参考文献：

[1]A.V Sturz，J Nowak. Endophytic communities of rhizobacteria and the strategies required to create yield

enhancing associations with crops[J].Applied Soil Ecology，2000，15（2）：183-190.

[2]关文灵.药用花卉乌头[J].植物杂志，2002（1）：16.

[3]李向楠，周稚凡，刘风路，等.云南榧种子内生真菌的分离鉴定及抑菌活性筛选[J].生物灾害科学，2016，39（1）：

20-26.

[4]李治滢，李绍兰，杨丽源，等.药用植物乌头内生真菌抗菌活性研究[J].现代农业科技，2009（22）：90-92.

[5]李治莹，陈有为，杨丽源，等.药用植物乌头内生真菌研究[J].现代农业科技2009（7）：7-8.

[6]Pandi M， Rajapriya P， Manoharan P T. Extraction and Characterization of Taxol： An Anticancer Drug from an

Endophytic and Pathogenic Fungi[M].Laboratory Protocols in Fungal Biology. Springer New York， 2013.