糖原合成激酶3β抑制剂通过p38负调节感染性炎性反应的研究*

陈 康，傅 强，卢建强，梁培松，韩 慧，董 谦，王伟佳

(广东省中山市人民医院检验医学中心，广东中山 528403)

铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，可引起医院获得性肺炎、角膜炎等多种机会感染[1-2]。尽管抗菌药物可以杀伤细菌，却不能抑制因感染而激发的过度免疫应答。因此，如何有效抑制过度免疫应答是预防免疫病理损伤和治疗疾病的关键。糖原合成激酶3β(GSK3β)是组织器官中广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可参与糖原合成，多种病理生理过程，如高血压、糖尿病、炎性肠病等[3-5]。此外，还可参与多种病原体感染引起的免疫应答，如病毒、真菌等[6-7]。磷酸化是调节GSK3β活性最常见的方式，其中以失活型9位丝氨酸(Ser9)的磷酸化最为常见，当Ser9的磷酸化水平降低时，提示在该疾病中GSK3β活性增高，破坏细胞的稳态，导致细胞发生氧化应激和炎性反应。丝裂原活性蛋白激酶(MAPK)是调节炎性反应通路中的重要分子，GSK3β可与MAPK家族中成员包括p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)协同调控细胞的炎性反应。GSK3β还可参与多种疾病的调控，被用作疾病治疗的靶点。GSK3β的小分子抑制剂SB216763可抑制其活性，调节免疫应答[8]，因此本研究旨在探讨感染铜绿假单胞菌时，GSK3β抑制剂调节细胞因子分泌及免疫功能的作用及机制。

1 材料与方法

1.1试剂 GSK3β抑制剂SB216763、p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125均购自美国MCE公司；p38、磷酸化p38(P-p38)、JNK、磷酸化JNK(P-JNK)、ERK、磷酸化ERK(P-ERK)、磷酸化GSK3β失活型9位丝氨酸[P-GSK3β(Ser9)]和β-actin的抗体均购自美国CST公司；Trizol、反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司；异丙醇和无水乙醇购自中国广州鼎国生物技术有限公司；实时荧光定量PCR(qPCR)检测用SYBR Green试剂盒购自美国Bio-Rad公司。

1.2细胞培养 小鼠巨噬细胞购自美国菌种保藏中心，细胞培养于DMEM培养基中。将4×105个/mL 小鼠巨噬细胞铺入12孔细胞培养板中，采用GSK3β抑制剂(10 μmol/L)、p38抑制剂(1 μmol/L)或JNK抑制剂(1 μmol/L)预处理细胞1 h，加入铜绿假单胞菌(MOI=1)刺激后，检测蛋白或mRNA水平的表达。

1.3免疫印迹试验(Western blot) 用冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞培养板中的细胞2次，加入蛋白裂解液，收集细胞裂解碎片，冰上裂解20 min。12 000 r/min离心10 min，收集蛋白裂解上清，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。接着进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并电转至硝酸纤维素膜上。将膜用5%脱脂奶粉室温孵育2 h，4 ℃过夜分别孵育一抗p38(1∶1 000)、P-p38(1∶1 000)、JNK(1∶1 000)、P-JNK(1∶1 000)、ERK(1∶1 000)、P-ERK(1∶1 000)、P-GSK3β(Ser 9)(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，室温下孵育二抗1 h，采用电化学发光方法检测蛋白水平。

1.4qPCR RNA抽提试剂法进行RNA提取，分光光度计测RNA浓度和纯度，用于下一步实验。将提取后的RNA(1 μg)转录为cDNA，详细步骤如下：RNA 1 μg，oligo(dT)1 μL，补DEPC水至体积12 μL，混匀；65 ℃，5 min；每孔加入5×反应液4 μL，20 U/μL RNA酶抑制剂1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，200 U/μL反转录酶1 μL，至总体积20 μL，混匀；42 ℃，60 min，70 ℃，5 min终止反应。反转录的cDNA保存备用。应用SYBR Green试剂盒进行扩增，详述如下：SYBR Green(2×) 10 μL，引物上下游混合液(5 μmol/L) 1.6 μL，cDNA模板2 μL，灭菌H2O补齐总体积20 μL充分混匀；按照两步法PCR扩增程序，第1步，95 ℃ 30 s，1个循环；第2步，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环PCR反应。反应结束后确认qPCR的扩增曲线和溶解曲线，得到循环阈值(Ct)值，采用2-ΔΔCT法进行相对定量。IL-10、IL-6和β-actin的引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结 果

2.1GSK3β参与到铜绿假单胞菌感染中 实验结果显示，在铜绿假单胞菌感染小鼠巨噬细胞6 h后，P-GSK3β(Ser9)水平增高，然后随感染时间的增加，水平下调。这些结果提示，GSK3β参与到铜绿假单胞菌感染中。见图1。

2.2GSK3β抑制剂调节细胞因子的表达 实验结果显示，在铜绿假单胞菌感染巨噬细胞后，GSK3β抑制剂SB216763可促进细胞因子IL-10水平的表达，同时抑制细胞因子IL-6水平的表达。结果提示抑制GSK3β可在铜绿假单胞菌感染中发挥免疫负调的作用。见图2。

2.3GSK3β抑制剂调节MAPK家族成员的磷酸化水平 实验结果显示，在铜绿假单胞菌感染后15 min、30 min和2 h，GSK3β抑制剂可上调p38和JNK的磷酸化水平，而对ERK的磷酸化水平无调节作用。实验结果同时发现，细菌感染前后，GSK3β抑制剂对p38、JNK和ERK的蛋白水平无调节作用。见图3。

注：A表示P-GSK3β(Ser9)蛋白表达水平随感染时间的变化情况；B表示P-GSK3β(Ser9)蛋白表达定量随感染时间的变化情况；***P<0.001
图1 GSK3β参与到铜绿假单胞菌感染中

注：A表示IL-10基因水平表达情况；B表示IL-6基因水平表达情况；*P<0.05;***P<0.001
图2 GSK3β抑制剂通过p38调节细胞因子的表达

图3 GSK3β抑制剂调节MAPK的磷酸化水平

2.4GSK3β抑制剂通过p38调节细胞因子的表达 实验结果显示，GSK3β抑制剂可上调细胞因子IL-10的表达，在应用GSK3β抑制剂的同时，应用p38抑制剂可抑制细胞因子IL-10的表达，应用JNK的抑制剂不可抑制IL-10的表达；GSK3β抑制剂可下调细胞因子IL-6的表达，在应用GSK3β抑制剂的同时，应用p38抑制剂可上调细胞因子IL-10的表达，而同时应用JNK的抑制剂不可上调IL-10的表达。这些结果提示，GSK3β抑制剂通过p38 MAPK信号通路调节细胞因子的表达。见图2。

3 讨 论

本研究发现，在感染铜绿假单胞菌时，GSK3β活性增高；GSK3β抑制剂可通过p38调节细胞因子的分泌，负调节免疫反应。

GSK3β参与到多种疾病的致病过程和病原体感染中[3-7]，因此被用作疾病治疗的靶点。研究报道，GSK3β的抑制剂可发挥免疫调控的作用[8]。MARTIN等[9]报道，抑制GSK3β可抑制多种配体激活的炎性反应，抑制促炎性细胞因子的表达，同时促进抑炎性细胞因子IL-10的表达。在败血症休克中，抑制GSK3β可上调抑炎性因子IL-10的表达[10]。然而，SHEN等[11]报道，GSK3β抑制剂SB216763可在心肌细胞中促进脂多糖诱导肿瘤坏死因子的表达。本课题组研究发现，GSK3β抑制剂SB216763可促进抑炎性细胞因子IL-10的表达，同时抑制促炎性细胞因子IL-6的表达，在铜绿假单胞菌感染中负调节免疫应答。

GSK3β可参与多个信号通路的调控，可通过抑制NF-κB信号通路或上调环磷腺苷效应元件结合蛋白抑制免疫应答[12]。NOH等[10]报道，GSK3β抑制剂可通过抑制ERK的活性上调抑炎性因子IL-10的表达。本课题组研究发现，GSK3β抑制剂可上调p38和JNK的磷酸化水平，并通过p38 MAPK信号通路调节细胞因子IL-10和IL-6的表达，发挥免疫负调节作用。

4 结 论

在感染铜绿假单胞菌后，GSK3β的活性增高；应用GSK3β的抑制剂SB216763可调节细胞因子的表达，负调节免疫应答；进一步实验发现，GSK3β抑制剂通过p38 MAPK信号通路调节细胞因子的表达。这些研究提示在铜绿假单胞菌感染中GSK3β可作为免疫调控的靶点。