乙醛脱氢酶1在乳腺癌转移淋巴结中的表达及其临床意义

杨丽青，刘 威

(广州市红十字会医院，暨南大学医学院附属广州红十字会医院乳腺科，广东 广州 510220)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，具有高度异质性，不同类型的乳腺癌治疗效果、预后差异较大[1]。经过规范的诊治后，患者还是可能因为最终的复发、转移而死亡。因此，有人提出肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)理论，期待能解决恶性肿瘤复发和转移的问题。CSCs理论认为，目前的治疗方法针对的靶细胞是已经分化的肿瘤细胞，并不能杀灭具有自我更新能力的CSCs，残留的少量CSCs是肿瘤复发、转移的原因[2]。乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)依赖性酶，具有催化乙醛氧化为乙酸的作用，在干细胞中呈现较高活性，是干细胞生长、分化的重要物质[3]。2007年有研究者利用ALDH1鉴定和分离出乳腺癌干细胞，为乳腺癌的研究开辟了新方向[4]。目前的研究结果认为，ALDH1的表达与乳腺癌患者的预后相关，是乳腺癌干细胞较理想的标志物之一[5]。但是，ALDH1在乳腺癌转移淋巴结中的表达及其临床意义的相关研究较少。因此，本研究检测了ALDH1在乳腺癌转移淋巴结中的表达，探讨其在乳腺癌转移淋巴结中表达的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2012年2月至2014年1月在广州市红十字会医院行乳腺癌手术患者的临床资料，其中乳腺癌转移淋巴结患者47例，未转移淋巴结患者15例。病例纳入标准：(1)女性；(2)原发乳腺浸润性导管癌，无远处转移；(3)术前未进行抗肿瘤治疗；(4)患者行单侧乳腺癌改良根治术；(5)术后按相关指南进行规范诊疗，保存完整的临床病案资料。淋巴结转移患者37～85岁，中位年龄60岁；淋巴结未转移患者40～78岁，中位年龄58岁，淋巴结转移和未转移患者年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 主要试剂与仪器兔抗人ALDH1多克隆抗体购自英国Abcam公司，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)购自北京索莱宝科技有限公司；光学显微镜购自日本尼康公司。

1.3 免疫组织化学法检测乳腺癌转移淋巴结和未转移淋巴结中ALDH1的表达将ALDH1多克隆抗体稀释100倍。取常规石蜡包埋的淋巴结组织标本连续切片，片厚4 μm。烤片、脱蜡、水化。切片放入微波炉加热的乙二胺四乙酸抗原修复液(150稀释) 中进行抗原修复，加热沸腾后持续10 min，随后自然冷却至常温。置于体积分数3%H2O2中室温孵育15 min。用山羊血清进行封闭，室温下孵育 30 min。滴加适量的ALDH1抗体，4 ℃冰箱湿盒内过夜。次日于37 ℃恒温箱中复温30 min。滴加适量的二抗，37 ℃恒温箱孵育30 min。滴加DAB显色剂(150配制)，控制反应时间(约20 s)，自来水冲洗5 min。苏木精复染、自来水冲洗5 min。盐酸乙醇分化约5 s，自来水冲洗20 min。梯度乙醇脱水，封片。参照FROMOWITZ等[6]的评分标准进行免疫组织化学评分，以镜下目标细胞的细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达，阴性表达细胞呈淡蓝色，400倍高倍镜下根据观察到的阳性细胞染色程度和阳性细胞比例进行半定量分析。阳性细胞所占比例评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞所占比例<25%为1分，≤25%阳性细胞所占比例≤50%为2分，50%<阳性细胞所占比例≤75%为3分，阳性细胞所占比例>75%为4分；染色程度：无染色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。二者得分总和即为最后评分，最终评分0～1分为阴性，2～7分为阳性。

1.4 统计学处理应用SPSS23.0软件进行统计学分析，计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验，采用Kaplan-Meier法进行生存分析；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌患者淋巴结中ALDH1表达情况结果见图1。47例乳腺癌转移淋巴结中ALDH1阳性表达率为36.17%(17/47)；15例未转移淋巴结中ALDH1阳性表达率为6.67%(1/15)；转移淋巴结中ALDH1阳性表达率显著高于未转移淋巴结，差异有统计学意义(χ2=4.804,P<0.05)。

A:转移淋巴结；B：未转移淋巴结。

图1 乳腺癌患者淋巴结中ALDH1表达情况(免疫组织化学染色，×400)

Fig.1 Expression of ALDH1 in lymph node of breast cancer patients(immunohistochemistry staining,×400)

2.2 乳腺癌患者转移淋巴结中ALDH1表达与临床病理特征的关系结果见表1。乳腺癌转移淋巴结中ALDH1表达与患者肿瘤临床分期、肿瘤直径、雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone，PR)、人类表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)、Ki-67表达情况及原发灶分子分型无关(P>0.05)，与肿瘤分级及淋巴结转移数有关(P<0.05)。

表1 ALDH1在乳腺癌转移淋巴结中的表达与患者临床病理特征的关系

Tab.1 Relationship of the expression of ALDH1 in metastatic lymph nodes of breast cancer and clinicopathological features of patients

临床病理特征nALDH1阳性/例(%)ALDH阴性/例(%)χ2P临床分期 II期228(36.4)14(63.6)0.0010.974 III期259(36.0)16(64.0)肿瘤直径 ≤2 cm164(25.0)12(75.0) 2～5 cm187(38.9)11(61.1)1.4840.476 >5 cm136(46.2)7(53.8)淋巴结转移数 1～3个349(26.5)25(73.5)5.0090.025 ≥4个138(61.5)5(38.5)肿瘤分级 I级152(13.3)13(86.7) II级145(35.7)9(64.3)6.3190.042 III级1810(55.6)8(44.4)ER +3512(34.3)23(65.7)0.2110.646 -125(41.7)7(58.3)PR +3313(39.4)20(60.6)0.4990.480 -144(28.6)10(71.4)HER-2 +126(50.0)6(50.0)1.3350.248 -35 11(31.4)24(68.6)Ki-67 ≥14%3614(38.9)22(61.1)0.4920.483 <14%113(27.3)8(72.7)原发灶分子分型 Luminal A 型123(25.0)9(75.0) Luminal B 型133(23.1)10(76.9)3.6330.304 HER2 过表达型115(45.5)6(54.5) 三阴型116(54.5)5(45.5)

2.3 生存分析结果见图2。乳腺癌转移淋巴结中ALDH1阳性表达患者和ALDH1阴性表达患者各死亡3例，5 a生存率分别为82.4%(14/17)、90.0%(27/30)，乳腺癌转移淋巴结ALDH1阳性表达患者与ALDH1阴性表达患者5 a生存率比较差异无统计学意义(χ2=0.576，P>0.05)。

A:转移淋巴结；B：未转移淋巴结。

图2 ALDH1表达阳性患者和ALDH1表达阴性患者生存期

Fig.2 Survival time of ALDH1 positive patients and ALDH1 negative patients

3 讨论

据统计，乳腺癌是世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤[7]。中国女性乳腺癌发病率和病死率低于欧美发达国家，但由于中国庞大的人口基数，每年仍有约27.9万的乳腺癌新发病例[8]。手术、化学治疗、内分泌治疗、靶向治疗、放射治疗、免疫治疗及综合治疗是乳腺癌的主要治疗方法。经过规范、合理的诊治，乳腺癌的预后有了明显改善，但最终还是有部分患者因出现复发、转移而死亡。因此，有学者提出CSCs理论，期待能解决恶性肿瘤复发、转移的问题。

CSCs理论认为，乳腺癌细胞中存在数量极少的、具有自我更新和多向分化潜能的细胞亚群，这类细胞亚群称之为乳腺癌干细胞，乳腺癌干细胞与乳腺癌的耐药、复发、转移等密切相关[9-11]。研究表明，多种实体肿瘤干细胞和造血干细胞中ALDH1呈高表达[12-13]。国内有学者对12个研究进行荟萃分析，结果显示，ALDH1在乳腺癌组织中的表达与其组织学分化差、ER 受体阴性、PR 受体阴性、HER-2阳性呈正相关，且与总生存率呈负相关[5]，DEMIR等[14]研究证实了该结果。总之，现有的研究认为，ALDH1在乳腺癌的发生、发展中具有重要作用，参与乳腺癌干细胞的分化，是乳腺癌干细胞较理想的标志物之一。

但是，ALDH1在乳腺癌转移淋巴结中的表达及其临床意义未明。目前，国内外只有少量关于乳腺癌转移淋巴结中ALDH1表达情况的研究。SAKAKIBARA等[15]的研究结果提示，乳腺癌转移淋巴结中ALDH1的高表达与患者不良预后相关；NOGAMI等[16]研究发现，ALDH1在腋窝转移淋巴结中的表达与原发灶组织学分级、腋窝淋巴结转移状态相关，而且在1～3个淋巴结转移的乳腺癌患者中与不良预后相关。国内有研究发现，乳腺癌前哨淋巴结中ALDH1的表达与乳腺癌原发灶的病理学类型、病理学分级、ER、PR、HER-2、分子分型、患者预后均无关，与肿瘤的腋窝淋巴结转移情况有关[17]。

本研究结果显示，ALDH1乳腺癌转移淋巴结中的阳性表达率显著高于未转移淋巴结，提示ALDH1可能参与乳腺癌的转移。分析乳腺癌转移淋巴结中ALDH1的表达情况与患者临床病理特征的关系发现，乳腺癌转移淋巴结中ALDH1的表达与患者的临床分期、肿瘤直径、原发灶分子分型、ER、PR、HER-2及Ki-67的表达情况无关，与肿瘤分级及淋巴结转移数有关，这与NOGAMI等[16]的研究结果一致。生存分析结果显示，乳腺癌转移淋巴结中ALDH1阳性表达患者与ALDH1阴性表达患者5 a生存率比较差异无统计学意义，表明乳腺癌转移淋巴结中ALDH1的表达与患者预后无关。本结果与NOGAMI等[16]的研究结论不一致，推测可能是本研究样本量较小，随访时间不够长导致的。未来期待扩大样本量、延长随访时间来进一步研究。