基于GC-MS/GC-O对白及花挥发性成分的分析

刘珍珍，苏莹，张斌，陈小华，3，李会宁，3，杨培君，3，*

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中723001；2.陕西省留坝县中药材发展办公室，陕西汉中723001；3.陕西理工大学陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中723001）

白及 Bletilla striata （Thunb.ex A.Murray）Rchb.f.为兰科白及属多年生草本植物，花期4月～5月。产于陕西南部、甘肃东南部、江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、四川和贵州[1]。白及块茎入药，具收敛止血，消肿生肌之功效[2]。近年来，由于白及在中医药及临床，美容及化妆品等领域的广泛应用，导致白及需求量增大[3]，进而刺激了白及的人工栽培；为减少开花、结实造成的营养消耗，白及花常被摘除。随着全国栽培面积的迅速增加，白及花已成为巨大的副产品。目前，白及花的成分及其活性研究已少量报道，黄进等[4]采用紫外分光光度法等，研究了不同干燥方法对白及花中花青素、多糖、总黄酮等含量的影响，评价了白及花清除DPPH 自由基和还原力的差异；吕婉婉等[5]测定了白及花中花青素的含量及其提取液的抗氧化活性，感官审评了白及花饮品开发的价值。此外，谢修超等[6]报道了白及花脂溶性成分的提取工艺优化，研究了其提取液的抗菌和抗肿瘤作用，证明其具有潜在的药用价值。

目前，气相色谱-质谱联用法（gas chromatographymass spectrometery，GC-MS）[7-9]和气相色谱-嗅闻测量法（gas chromatography-olfactometer，GC-O） 已被广泛的用于研究香气成分和香气特征[10-11]。如菊花[10]、栀子花[12]、柑橘花[13]、板栗花[14]等花的香气成分研究和茶的香气成分及香气特征的研究[15-16]；但关于白及花的挥发性成分及花气味特征的研究尚未见报道。为促进白及资源综合利用与产业的健康发展，本研究以白及花蕾、展瓣花的鲜花和干燥样品，采用GC-MS/GC-O 相结合的方法，开展白及花挥发性成分及气味特征分析，以期为白及花资源利用或花产品研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

白及鲜花：2018年 4月 16 日～20 日采样于陕西省汉中市武乡白及种植基地。所采样本，经由陕西理工大学王勇博士鉴定，为兰科植物白及Bletilla striata（Thunb.ex A.Murray）Rchb.f.。将采集的白及花花蕾和展瓣花分别作鲜花保存（花蕾、展瓣花直接装入自封袋并于-18 ℃低温冷冻保藏）和干燥处理（花蕾和展瓣花于电热鼓风干燥箱45 ℃及时烘干后，置自封袋中保存，备用），共有4 个样品：展瓣干花、展瓣鲜花、干燥花蕾、花蕾鲜花。

1.2 试剂与仪器

二氯甲烷、无水硫酸钠（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；XH-SDE 同时蒸馏萃取装置：上海玻璃仪器厂；Trace Ultra GC-ITQ900 MS 气相色谱-质谱联用仪：美国热电公司；GC2010 plus-OPV277 气相色谱－嗅辨联用仪：日本岛津公司；MTN-2800D 氮吹仪：上海那艾精密仪器公司；UPH-II-40 优普超纯水机：成都超纯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白及花挥发性成分的提取

挥发性成分提取采用同时蒸馏-萃取法（simultaneous distertraction extraction，SDE）[17-18]：称取白及花展瓣鲜花、花蕾鲜花样品各20.0 g，根据测样的含水量比例称取展瓣干花1.91 g、干燥花蕾4.44 g，分别置于2 000 mL 圆底烧瓶中，加超纯水500 mL；取另一200 mL圆底烧瓶中加入25.0 mL 二氯甲烷，将圆底烧瓶接入SDE 装置，样品端使用电热套加热至水沸腾，有机溶剂端使用水浴恒温至50 ℃，待白及花样品侧沸腾且冷凝管有回流液出现时计时，提取时间为1 h，后停止加热；收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥脱水，于4 ℃冰箱中静置过夜。将有机相用氮吹法将其浓缩至约1 mL，制得待测样品，于-20 ℃冰箱密闭保存，备用。

1.3.2 白及花挥发性成分的鉴定及含量分析

采用GC-MS 方法分析。色谱条件：色谱柱为InertCap-Wax（30 m×0.25 μm×0.25 mm）；载气为氦气（99.999%）；采用升温程序：起始温度40 ℃保持5 min，然后以3 ℃/min 速率升温至250 ℃时保持5 min。进样口温度200 ℃，传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，电离源为EI 源，能量70 eV；质谱扫描范围40 amu～400 amu，扫描速率1 scan/s，进样方式采用不分流进样，进样量 2.0 μL。

定性及定量分析：根据质谱数据GC-MS 联用仪标准图谱NIST14 质谱库检索，使用AMDIS-32 版本软件及相关资料进行分析，匹配度大于70%以上记录，确定其化学成分；按峰面积归一法计算各组成成分的相对含量。

1.3.3 白及花气味特征分析

采用文献[19]的GC-O 方法对白及花气味特征及强度进行鉴定。色谱条件与GC-MS 操作条件相同，进样量4.0 μL。色谱柱末端分流比为1 ∶1，样品通过色谱柱分别进入GC 检测器端和嗅闻仪嗅闻口端，在色谱分析的同时，嗅闻人员在嗅闻口处对色谱分离出来的气味化合物进行嗅闻，判断并记录气味化合物的气味特征和强度，同时通过GC-O 应用系统自动记录每种气味化合物的保留时间。在嗅闻过程中，为防止嗅闻人员鼻腔受到高温的损伤，在嗅闻口端通入了温度为170 ℃，流速为100 mL/min 的湿热空气。

气味特征及强度评判方法：采用Chen 等[19]的量化评分方法，将气味强度分为6 个等级。其中，“0.0”级为无气味，“1.0”级为弱，“2.0”级为较弱，“3.0”级为中，“4.0”级为较强，“5.0”级为强。要求评价人员根据这6个气味强度等级对所嗅闻到的气味进行评价打分。每试验3 次，每种气味物质的最终强度值为6 位评价人员打分结果的平均值，并取整数。

1.3.4 气味轮廓分析

称取白及展瓣鲜花和花蕾鲜花各10.0 g，根据测样的含水量比例称取白及展瓣干花0.96 g 和干燥花蕾2.22 g。用150 mL 100 ℃的水冲泡5 min，并将白及花汤沥出，由以上6 名评价人员对茶汤中的高强度气味特征进行嗅闻。气味强度判定标准同GC-O 分析，最后根据感官分析结果绘制白及花气味特征轮廓。

1.3.5 数据处理

各组分通过计算机在NIST 14 质谱库匹配，确定化合物种类，采取峰面积归一法计算各组成成分的相对含量。数据使用Originpro 2017 软件、SPSS Statistics 20 软件和Microsoft Excel 2010 软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 白及花挥发性成分分析

白及花挥发性成分及其相对百分含量见表1。白及花4 种样品的GC-MS 分析结果如图1 所示。展瓣干花、展瓣鲜花、干燥花蕾和花蕾鲜花4 个样品中，共检测出挥发性成分71 种，包括醇类13 种（18.31%），醛类 16 种（22.54%），酯类 8 种（11.27%），酚类 3 种（4.23 %），酸类 2 种（2.82 %），酮类 5 种（7.04%），烷烃类9 种（12.68%），烯烃类 6 种（8.45%）和其它类9 种（12.68%）；其中，展瓣干花、展瓣鲜花、干燥花蕾和花蕾鲜花分别鉴定出挥发性化合物28、39、37 种和32 种（表1）。由表1 可看出，花蕾与展瓣花的干燥和鲜花样品间存在一定的差异。其中，展瓣鲜花的主要成分有苯乙醇（10.14%）、苯甲醇（17.59 %）、（E）-2-庚烯醛（5.35 %）、正十五烷（10.60 %）、对甲酚（6.36%）、十八烯（10.71%）；展瓣干花的主要成分有正己醛（7.64%）、（E）-2-庚烯醛（5.91%）、反式-2，4-癸二烯醛（6.92%）、正十七烷（7.42%）、正十五烷（7.58%）、月桂酸甲酯（20.89%）、对甲酚（10.35%）；干燥花蕾的主要成分有辛酸甲酯（76.8%）；而花蕾鲜花的主要成分有月桂酸甲酯（11.88 %）、反式石竹烯（36.32%）。主要成分中，十八烯仅在展瓣鲜花中检测出，辛酸甲酯在干燥花蕾检出，而反式石竹烯只在花蕾鲜花中被检出，说明这3 种化合物对白及花气味的释放贡献较小。而正十七烷和正十五烷2 种成分没有气味，二者对白及花气味的释放贡献度较低。展瓣鲜花与干花相比，苯乙醇、苯甲醇、正己醛等主要气味贡献化合物呈下降趋势，而月桂酸甲酯和对甲酚有明显上升趋势，说明白及花在干燥过程中其挥发性物质存在一定的变化。

表1 白及花挥发性成分及其相对百分含量Table 1 Volatile components and relative percentage content in Bletilla striata flowers

续表1 白及花挥发性成分及其相对百分含量Continue table 1 Volatile components and relative percentage content in Bletilla striata flowers

图1 白及花4 种样品的GC-MS 总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram four samples of Bletilla striata flowers obtained by GC-MS

由表1 可知，白及展瓣干花中，醛类、烷烃类、酯类含量相比较多，其主要成分是正己醛、月桂酸甲酯、正十五烷等，而酸类和酮类则未检测出。展瓣鲜花中，醇类、醛类、烷烃类等含量相比较多，其主要成分是苯甲醇、（E）-2-庚烯醛、正十五烷等。而干燥花蕾中，酯类、醛类和醇类相对含量较高，其主要成分是辛酸甲酯、反式-2，4-癸二烯醛、正己醇等。花蕾鲜花中，烯烃类、酯类和酚类相对含量较高，其主要成分为反式石竹烯、月桂酸甲酯和对甲酚等，而酮类则未被检测出。基于此，正己醛、月桂酸甲酯、苯甲醇、（E）-2-庚烯醛、正十五烷、辛酸甲酯、反式-2，4-癸二烯醛、正己醇、反式石竹烯和对甲酚10 种化合物为白及花主要的挥发性成分。

2.2 白及花挥发性成分的含量分析

白及花中，挥发性成分有9 类，包括醇类、醛类、酯类、酚类、酸类、酮类、烷烃类、烯烃类和其它类。白及花的主要组成成分及其相对含量比较见表2，白及花挥发性成分比较分析见图2。

由表2 和图2 可知，2 个不同花期和2 种不同收集方法中9 类化合物的组分及百分含量有明显变化。展瓣干花的醛物质类物质相对含量高，酯类次之，酸类和酮类则未被检测出。展瓣鲜花的醇类物质相对含量高，醛类次之，酸类的含量最少。干燥花蕾的酯类物质相对含量高，醛类次之，酚类含量最少。花蕾鲜花的烯烃类相对含量高，酯类次之，酸类含量最少，酮类则未被检测出。因此，从挥发性物质的相对含量比看出，醇类、醛类、酯类、烯烃类等是主要化合物。根据含水率折算成同样质量分数的情况下，不同白及花样品中挥发性物质的含量变化如下。

表2 白及花的主要组成成分及其相对含量比较Table 2 The main components and the relative percentage content of Bletilla striata flowers

图2 白及花挥发性成分比较分析Fig.2 Comparative analysis of volatile components of Bletilla striata flowers

醇类化合物：鲜花从花蕾期的5.11%到展瓣花期的34.85%，含量增高了约6.8 倍；而干燥花从花蕾期的7.09%到展瓣花期的5.37%，含量则下降了约1.3倍。仲辛醇、三甲基苯甲醇仅在干燥花蕾中检测到，叶醇、糠醇只在花蕾鲜花中检测出；此外，苯甲醇在4 个样品中均被检测出，且在展瓣花期的鲜花中含量最高。

醛类化合物：鲜花从花蕾期的5.22%到展瓣花期的21.98%，含量上升了约4.2 倍；而干燥花从花蕾期的10.58%到展瓣花期的42.35%，含量上升了约4.0倍。3-甲硫基丙醛仅在干燥花蕾中检测出，十一醛只在花蕾鲜花中检测到。此外，壬醛、苯甲醛、反式-2，4-癸二烯醛等在4 个样品中均被检出，且在展瓣干花中含量较高。

酯类化合物：鲜花从花蕾期的29.54%到展瓣花期的2.41%，含量下降了约12.3 倍；而干燥花从花蕾期的77.39%到展瓣花期的21.92%，含量下降了约3.5 倍。其中，辛酸甲酯、己酸己酯、异戊酸己酯仅在干燥花蕾花中检测出，且辛酸甲酯的相对含量高。乳酸乙酯、月桂酸乙酯则只在展瓣干花中被检出，而酞酸二乙酯只在展瓣花鲜花中检出。

酚类化合物：鲜花从花蕾期的11.98%到展瓣花期的7.08%，含量下降了约1.7 倍；而干燥花从花蕾期的0.17%到展瓣花期的10.72%，含量增加了约13.1倍。其愈创木酚只在展瓣花期鲜花中检测出，而对甲酚则在4 个样品中均被检测出。

烷烃类化合物：鲜花从花蕾期的8.03%到展瓣花期的18.47%，含量增加了约2.3 倍；而干燥花从花蕾期的0.57 %到展瓣花期的15.60 %，含量上升了约27.4 倍。其中，1-碘壬烷仅在干燥花蕾中检测出，且相对含量低。

烯烃类化合物：鲜花从花蕾期的38.44%到展瓣花期的11.79%，含量下降了约3.3 倍；而干燥花从花蕾期的1.24%到展瓣花期的0.91%，含量下降了约1.4 倍。2-甲基-1-戊烯、反式石竹烯、1-十二烯只在花蕾鲜花中检测出，且后者的百分含量小于0.01，而十八烯仅在展瓣鲜花中被检出。

其它类化合物：鲜花从花蕾期的0.96%到展瓣花期的1.84%，含量上升了约1.9 倍；干燥花从花蕾期的0.26%到展瓣花期的3.84%，含量增加了约14.8 倍。3-甲基苯并噻唑仅在展瓣干花中检测出，吲哚、苏丹兰只在展瓣鲜花中检测出。樟脑则仅在干燥花蕾中检测出；1，4-桉叶素只在花蕾鲜花中检测出。

2.3 白及花气味特征及气味轮廓分析

2.3.1 白及花气味特征及关键气味化合物分析

白及花挥发性成分及主要气味特征构成的GC-O分析结果，见表3。

表3 白及花气味特征分析结果Table 3 Odor characteristics of Bletilla striata flowers

白及花挥发性成分主要由10 种气味特征构成，包括青草气、油脂气、花香气、果香气、土香气、蜜香气、甜香气、芳香气、紫罗兰香气和药香气。其中，青草气来源于正己醛、（E）-2-庚烯醛，油脂气来源于正己醇、百里酚，花香气来源于壬醛、芳樟醇、月桂酸甲酯、苯乙醇，果香气来源于苯甲醛、橙花叔醇，药香气来源于正辛醇、愈创木酚、对甲酚，土香气来源于4-萜烯醇，蜜香气来源于苯乙醛，甜香气来源于（E，E）-2，4-壬二烯醛、茴香脑，芳香气来源于苯甲醇、苯并噻唑，紫罗兰香气来源于β-紫罗酮。这些化合物为白及花气味的重要贡献化合物。

气味强度分析结果显示，青草气、花香气、果香气、药香气气味强度最高，甜香气、芳香气气味强度较弱，而油脂气、土香气、蜜香气、紫罗兰香气的气味强度为弱。

2.3.2 白及花气味轮廓分析

基于GC-O，结合感官分析的白及花气味轮廓见图3，白及花4 种样品的挥发性气味差异明显。

图3 基于GC-O 及感官分析的白及花气味轮廓Fig.3 Aroma profile of Bletilla striata flowers based on GC-O and sensory analysis

分析结果显示，白及花气味特征主要被描述为青草气、花香气、药香气、蜜香气、果香气等。展瓣鲜花的整体气味强度高于展瓣干花，其青草气、花香气、药香气、果香气、芳香气的气味强度较高。正己醛、（E）-2-庚烯醛、壬醛、芳樟醇、月桂酸甲酯、愈创木酚、对甲酚、苯甲醛、橙花叔醇、苯甲醇和苯并噻唑等11 种气味组分，在白及展瓣鲜花气味特征形成中扮演重要角色。干燥花蕾中果香气气味强度最高，苯甲醛、橙花叔醇在白及干燥花蕾气味特征形成中起主导作用。花蕾期鲜花的药香气气味强度最高，主要气味组分为对甲酚。

除嗅闻出的化合物以外，在白及花中有2 个刺激性的未知化合物被嗅闻出。这些化合物虽不能被GCMS 检测到，但是它仍能被人的嗅觉器官所感知，这些未知化合物的鉴定以及对白及花气味特征的影响有待于进一步研究。

3 讨论与结论

本研究采用SDE-GC-MS、GC-O 技术，结合感官评价，对白及花的挥发性物质和气味属性进行初步分析。分析结果表明，白及花共检测出71 种挥发性成分，包括醇类、醛类、酯类、酚类、酸类、酮类、烷烃类、烯烃类、其它类。这些化合物的含量，从花蕾期到展瓣花期大多呈现明显增加的趋势，而酯类化合物含量则呈现下降。

据研究报道，花气味或挥发性物质随不同植物的花器官、不同花期、不同花部位或不同干燥方法而表现出一定的差异[10-14，20]。白及干燥花蕾中辛酸甲酯含量最高，可以达到76.8%，而月桂酸甲酯在花蕾鲜花中的含量较高（29.31%），十八烯和对甲酚分别在展瓣鲜花、花蕾鲜花中的含量相对较高（10.71 %，11.88 %）；辛酸甲酯仅在干燥花蕾中检测出，但在GC-O 及感官分析的白及花气味轮廓中并未体现出，说明辛酸甲酯对白及花中的主体气味贡献度较少。烷烃类化合物虽然含量较高，但本身没有气味，因此该类化合物对白及花气味特征贡献度较低。形成白及花气味特征的主要贡献化合物有16 种，包括正己醛、（E）-2-庚烯醛、壬醛、芳樟醇、月桂酸甲酯、苯乙醇、苯甲醛、橙花叔醇、正辛醇、愈创木酚、对甲酚、苯乙醛、（E，E）-2，4-壬二烯醛、茴香脑、苯甲醇和苯并噻唑。

花香是植物繁殖器官在生长发育中，通过次生代谢所释放出的小分子化合物，一方面与植物的传粉或信息传递有关，另一方面也与人类的健康密切相关[20-21]。黄进等指出，不同干燥方法对白及花的保色效果、花青苷、黄酮及酚类化合物的含量显著影响[4]。白及鲜花不具明显的气味特征，GC-MS/GC-O 检测结果显示，共检测出的71 种9 类化合物的含量，从花蕾期到展瓣花期大多呈现明显增加，而酯类化合物含量则呈现下降。白及花的提取液中干燥花的气味强度明显大于鲜花。说明白及花在成熟过程或热化过程中，促进了挥发性物质的内在氧化、分解或转化。

植物花器官的经济价值及其利用常用为观赏、药用、食药两用或食品资源，如菊花、玫瑰花、金银花、石斛花等。白及花含花青素、多糖、黄酮类、酚类等多种活性成分[4]，具有清除自由基和抗氧化作用[4-5]、抗菌和抗肿瘤等作用[6]。吕婉婉等在白及花沸水冲泡物的感官审评中指出，白及花具有开发成饮料的潜力[5]。因此，白及花作为制作饮品、炮制花茶，或作为功能型健康产品研发的原料等具有重要的资源价值。本研究结果，可为白及花资源利用或花产品研发提供参考资料。