具有增强免疫作用的铁皮石斛灵芝酒的研制

吴月国，赵铮蓉，吴蓓丽，张萍，梁世宝，刘骅，*

（1.浙江省医学科学院，浙江杭州310013；2.温州市中心医院，浙江温州325000）

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是传统名贵中药材，具有降糖、降脂、抗炎、护肝等作用[1-4]。灵芝为多孔菌科真菌赤芝（Ganoderma Lucidum Karst.）或紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）的干燥子实体，亦是传统名贵中药材，具有补气安神、止咳平喘、抗癌、降压等功效[5-7]。保健酒是将中药与酒“溶”于一体的药酒，不仅配制方便、药性稳定、安全有效，而且因为酒精是一种良好的半极性有机溶剂，药借酒力、酒助药势而充分发挥其效力，提高疗效。铁皮石斛灵芝酒是以铁皮石斛与灵芝为主要原料，依据中医养生理论组方，经配方、工艺筛选后精制而成的保健酒。本研究采用提取、浸泡、配制等工艺制备铁皮石斛灵芝酒，考察其对小鼠的免疫调节作用，以期进一步的开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛：浙江民康天然植物制品有限公司；灵芝、黄精、枸杞：华东医药股份有限公司药材参茸分公司；白酒：建德市严东关酒厂；ICR 小鼠：浙江省实验动物中心。

无水葡萄糖：中国食品药品检定研究院；苯酚：国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸：西陇化工股份有限公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；印度墨汁：南京都莱生物技术有限公司；刀豆蛋白ConA：美国sigma 公司；噻唑蓝、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；0.22 μm孔径滤膜：密理博中国有限公司；RPMI1640 培养基：美国gibco 公司；YAC-1 细胞：中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所；红细胞裂解液：浙江省医学科学院药物研究所自配（配方：NH4Cl 0.3735 g，Tris 0.13 g，溶于 50 mL 双蒸水，0.22 μm 过滤除菌后使用）。

1.2 仪器

T6 新世纪分光光度计：北京普析通用仪器责任有限公司；AG285 型电子天平、XS205 型电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；DM5500BLED 型荧光显微镜：德国莱卡公司；THERMO 3111 培养箱：美国赛默飞世尔科技公司；BIORAD 680 酶标仪：美国伯乐公司。

1.3 方法

1.3.1 铁皮石斛灵芝酒制备和含量测定

铁皮石斛灵芝酒是以铁皮石斛、灵芝为主要原料，复配黄精和枸杞子，经提取、浸泡、配制等主要工序精制而成[8-9]，人体推荐剂量为每人每日100 mL。苯酚-浓硫酸法测定粗多糖含量[10]。

1.3.2 铁皮石斛灵芝酒免疫活性测定

1.3.2.1 小鼠分组与给药

ICR 小鼠，清洁级，雄性，体重 17 g～21 g，由浙江省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2016-0010。实验动物饲料由协同医药生物工程公司提供，执行标准GB 14924.3《2010 实验动物配合饲料营养成分》。饮用水为灭菌城市饮用水，符合GB 5749-2006《生活饮用水卫生标准》的规定。挑选健康ICR 小鼠，按照运动能力，体重状况分成4 组：阴性对照组、铁皮石斛灵芝酒低、中、高剂量组，每组10 只。实验前先将铁皮石斛灵芝酒浓缩20 倍，然后按人体推荐量的5、10、30 倍剂量配置成低剂量、中剂量、高剂量（8.33、16.67、50.00 mL/kg）的酒精度为 15°的供试品；阴性对照组为15°白酒。供试品灌胃体积为20 mL/kg，每天一次，连续30 d[11-13]。

1.3.2.2 免疫器官重量与脏器系数测定

灌胃给药30 d，小鼠断颈处死，75%酒精消毒，无菌解剖，取胸腺，脾脏，肝脏，除去残留在脏器上的血液，秤重。最后用所得数据计算脏器指数。脏器指数（g/10 g）=器官质量/体质量。

1.3.2.3 二硝基氯苯诱导的小鼠耳肿胀实验

第24 天灌胃给药后1 h，将1%二硝基氯苯丙酮橄榄油（丙酮：橄榄油体积比1 ∶1）涂抹在小鼠腹部，涂抹剂量为每只100 uL。给药第25 天，重复以上步骤。给药第29 天，各组小鼠右耳前后面均匀涂抹1%二硝基氯苯丙酮橄榄油，涂抹剂量为每只100 μL。各组小鼠左耳以同等方式涂抹橄榄油混合液作为对照。1 d 后，处死小鼠，剪下两边耳壳。剪取部位应在同一部位。取下耳片形状均为椭圆形。小鼠迟发型变态反应由左右耳重量差表示。

1.3.2.4 碳粒廓清实验

灌胃给药30 d，将印度墨汁用生理盐水稀释5 倍。注射入小鼠体内小鼠躯干发黑（0.1 mL/10 g）。在注射后 2、10 min 从眼眶静脉丛取血 20 μL，加入到 2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，600 nm 波长测定OD 值，并将小鼠处死，取肝脏、脾脏，称重。整理得吞噬指数。

1.3.2.5 脾淋巴细胞体外增殖作用实验

取1.3.2.2 所得小鼠脾脏，装于含磷酸缓冲盐溶液的培养皿中，以5 mL 注射塞碾磨，混匀，200 目灭菌双层尼龙筛过滤。合并滤液，1 500 r/min 离心5 min，弃上清，弹匀后加少量破红裂解液，以磷酸缓冲盐溶液中和破红，1 500 r/min 再次离心5 min，弃上清，以含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液轻轻吹打重悬沉淀。调整小鼠脾细胞为 1.5×109个/mL，100 μL/孔种板于 96孔中。设对照组，铁皮石斛灵芝酒低、中、高剂量组；各组又分单独处理组和联合ConA（5 μg/mL）组；每孔加入供试品100 uL，于37 ℃，5%CO2培养箱中培养44 h后，每孔加入噻唑蓝（5 mg/mL）20 μL 继续培养 4 h。以移液枪小心吸去上清，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，37 ℃孵育20 min，490 nm 测定OD 值。计算增殖指数：增殖指数=（OD样品-OD空白）/（OD对照-OD空白）

1.3.2.6 小鼠NK 细胞的活性测定

靶细胞的传代（YAC-1 细胞）：实验前24 h 将靶细胞进行传代培养。应用前以磷酸缓冲盐溶液洗3 次，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。

小鼠脾细胞悬液的制备（效应细胞）：方法同1.3.2.5。

NK 细胞活性检测：取靶细胞和效应细胞各50 μL（效靶比 50 ∶1），加入 U 型 96 孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各50 μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%聚乙二醇辛基苯基醚各50 μL。

设对照组，铁皮石斛灵芝酒低、中、高剂量组；各组又分单独处理组和联合ConA 组；每孔加入供试品100 μL，于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 24 h，然后将96 孔培养板以1 500 r/min 离心5 min，每孔吸取上清120 μL 置平底96 孔培养板中，同时加入乳酸脱氢酶检测工作液 60 μL，混匀，室温（约 25 ℃）避光孵育30 min（用铝箔包裹后置于水平摇床上缓慢摇动）。然后在490 nm 处测定吸光度。计算NK 细胞活性：

NK 细胞活性/%=（反应孔OD-自然释放孔OD）/（最大释放孔OD-自然释放孔OD）

1.4 数据分析

各组数据用表示，采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛灵芝酒含量测定

粗多糖含量测定标准曲线为：y=0.056 0x-0.006 4，r=0.999 8，每100 mL 铁皮石斛灵芝酒中粗多糖（以无水葡萄糖计）含量约为160 mg。

2.2 免疫器官重量及脏器系数测定结果

免疫器官重量及脏器系数测定结果见表1。

表1 小鼠脏器指数表（）Table 1 Effect of the spleen and thymus index on mice（）

表1 小鼠脏器指数表（）Table 1 Effect of the spleen and thymus index on mice（）

注：与阴性对照组比较，**表示差异极显著，P＜0.01。

肝脏/体重比值/（g/10 g）阴性对照组 0 0.044±0.004 0.015±0.002 0.556±0.026低剂量组 8.33 0.048±0.004 0.048±0.004** 0.539±0.037中剂量组 16.67 0.046±0.005 0.046±0.005** 0.520±0.016**高剂量组 50.00 0.045±0.003 0.014±0.002 0.533±0.028组别 剂量/（mL/kg）脾脏/体重比值/（g/10 g）胸腺/体重比值/（g/10 g）

与阴性对照组比较，铁皮石斛灵芝酒各剂量组小鼠脾脏/体重比值均无统计学意义（P＞0.05）；低、中剂量组的胸腺/体重比值有显著差异（P＜0.01）；铁皮石斛灵芝酒各剂量组小鼠肝脏/体重比值均明显下降，其中中剂量组有显著差异（P＜0.01）。

2.3 二硝基氯苯诱导的小鼠耳肿胀实验结果

小鼠耳肿胀实验结果见表2。

与阴性对照组比较，在引发超敏反应后，铁皮石斛灵芝酒高剂量组小鼠右耳肿胀明显。中、低剂量组肿胀度有下降趋势，尤其中剂量组肿胀度下降趋势明显，但也不具统计学意义（P＞0.05）。

表2 小鼠耳肿胀实验结果（）Table 2 Effect of the ear swelling experiment on mice（）

表2 小鼠耳肿胀实验结果（）Table 2 Effect of the ear swelling experiment on mice（）

组别剂量/（mL/kg）肿胀度/mg阴性对照组 0 3.83±2.83低剂量组 8.33 3.60±1.80中剂量组 16.67 1.99±1.24高剂量组 50.00 5.09±2.66

2.4 碳粒廓清实验结果

碳粒廓清实验结果见表3。

表3 碳粒廓清实验结果（）Table 3 Effect of the carbon clearance index（）

表3 碳粒廓清实验结果（）Table 3 Effect of the carbon clearance index（）

注：与阴性对照组比较，*表示差异显著，P＜0.05。

组别剂量/（mL/kg）吞噬指数阴性对照组 0 3.78±1.181低剂量组 8.33 4.46±0.80中剂量组 16.67 4.81±0.56*高剂量组 50.00 4.34±1.16

与阴性对照组相比，铁皮石斛灵芝酒各剂量组小鼠的吞噬指数均增加，中剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）。表明铁皮石斛灵芝酒能提高小鼠碳廓清能力，单核-巨噬细胞功能实验结果阳性。

2.5 脾淋巴细胞体外增殖作用的影响试验结果

脾淋巴细胞增殖能力的测定结果见表4。

表4 脾淋巴细胞增殖能力的测定结果（）Table 4 Effect of the transformation level of lymphoid on mice（）

表4 脾淋巴细胞增殖能力的测定结果（）Table 4 Effect of the transformation level of lymphoid on mice（）

注：各给药组与正常细胞组比较，**表示差异极显著，P＜0.01。ConA处理组与正常细胞组比较，#表示差异显著，P＜0.05，##表示差异极显著，P＜0.01。

增殖指数（联合ConA 处理）阴性对照组 0 1±0.03 2.17±0.42#低剂量组 8.33 1.12±0.21 1.17±0.12中剂量组 16.67 7.4±0.15** 5.37±1.78高剂量组 50.00 10.39±0.64** 11.77±0.17##组别剂量/（mL/kg） 增殖指数（单独处理）

如表4 所示，单独给药时，铁皮石斛灵芝酒具有明显的促淋巴细胞增殖作用，并且这一作用呈浓度依赖性增加。ConA 联合处理组对小鼠淋巴细胞增殖有一定的促进作用，高剂量组与对照组相比有显著性差异。联合给药时，铁皮石斛灵芝酒各剂量组刺激脾淋巴细胞增殖程度均较单独给药时没有显著性差异，提示其与ConA 没有协同促进作用。

2.6 NK细胞活性测定结果

NK 细胞活性测定结果见表5。

表5 NK 细胞活性测定结果（）Table 5 Effect of the activity of natural-killer cells（NK）on mice（）

表5 NK 细胞活性测定结果（）Table 5 Effect of the activity of natural-killer cells（NK）on mice（）

注：联合ConA 处理组与正常细胞组比较，*表示差异显著，P＜0.05。

NK 细胞活性/%（联合ConA 处理）阴性对照组 0 -6.48±6.24 -25.50±18.85低剂量组 8.33 13.06±28.89 64.37±19.64*中剂量组 16.67 -3.55±6.30 -3.13±0.73高剂量组 50.00 -4.08±2.02 -5.02±1.27组别剂量/（mL/kg） NK 细胞活性/%（单独处理）

在对NK 细胞活性测定试验中，与阴性对照组相比，铁皮石斛灵芝酒单独处理组及联合给药高、中剂量组对小鼠NK 细胞活性无显著影响，铁皮石斛灵芝酒单独处理及联合给药低剂量组有增加NK 细胞活性趋势，且联合给药低剂量组与对照组存在显著性差异。

3 结论

依据传统中医养生理论配伍的铁皮石斛灵芝酒中，主料铁皮石斛滋阴补虚，益脾肺肾，护肝胆，填五脏内虚不足；配伍灵芝，滋肝健脾，养血安神；黄精，枸杞子，滋肾阴补脾气益精血，以助滋阴培本之力；白酒辛温走散，引药入血；诸品合用共奏滋阴精益肝脾，以达培本清源之功。本研究中，将铁皮石斛、灵芝、黄精、枸杞子添加到白酒浸提，制成铁皮石斛灵芝酒，采用现代药效学的研究方法，评价其对小鼠的免疫调节活性，结果显示铁皮石斛灵芝酒能提高小鼠胸腺指数，降低小鼠耳肿胀度，促进淋巴细胞增殖，增加小鼠吞噬指数和NK 细胞活性。表明铁皮石斛灵芝酒各组分组成的一个整体，产生了协同作用，具有增强免疫力的保健功能，可用于开发增强免疫力作用的保健食品或药物。