电子烟雾化剂丙二醇的大鼠90天吸入毒性研究

2019-11-14高峄涵严大为郑赛晶盛云华周慧明沈轶

中国烟草学报 2019年5期

高峄涵，严大为，郑赛晶，盛云华，周慧明，沈轶*

1 上海新型烟草制品研究院，上海市虹口区大连路789号 200082;2 上海市食品药品检验所，上海市浦东新区张衡路1500号 201203

1, 2-丙二醇（PG，propylene glycol）是一种无色无味的粘稠液体，由于其具有保湿、抗冻、润滑和良好溶解性等特性，在食品、药品和化妆品中被广泛用作添加剂。同时PG还具有良好的雾化效果，常作为电子烟烟液中的主要雾化剂。

PG作为可以被消费者直接摄入或接触的化学物质，其使用安全性方面有较多的研究和规范。美国毒物和疾病登记署（ATSDR）[1]数据显示，大鼠经口途径PG的LD50为8～46 g/kg，成人口服PG的LD50估计超过15 g/kg。同时我国《GB 2760-2014 食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定，丙二醇在生湿面制品（如面条、饺子皮、馄饨皮、烧麦皮）规定最大使用量1.5 g/kg，糕点生产中最大使用量要求为3.0 g/kg；在口服药物方面，成人每日PG摄入量的阈值剂量可高达25 mg/kg/天[2-3]；在日用化妆品方面，根据1993年的美国化妆品成分审查（CIR）报告得出结论，浓度高达50%的PG可安全地用于化妆品制品[4]。然而经口摄入过高剂量的PG也可能引起心血管和肾衰竭，中枢神经系统异常，酸碱异常和高渗等症状[2-3]，经皮接触过量PG时也可能引起皮肤过敏[5]。其它特殊途径接触如静脉注射PG也可能引起不良反应[6]。

作为电子烟烟液雾化剂，PG吸入途径的安全性也有部分研究。Montharu等[7]采用气管内滴注进行研究发现PG的致炎症程度较低，肺部耐受性较好。在亚慢性90天吸入毒性试验研究中，大鼠暴露浓度为2.2 mg/L的雾化PG，可引起雌性大鼠体重下降、杯状细胞数量增加、鼻腔粘液增加、鼻出血及眼部分泌物增多等症状[8]。PG在其他物种中的吸入毒性研究也证明吸入PG毒性相当低[9-11]。目前，未发现有文献报道PG对大鼠或人类具有致癌性、致突变或生殖发育毒性[2-3]。

随着电子烟的出现和流行，消费者在使用电子烟的过程中接触大量的PG。有文献报道暴露于雾化PG中1分钟（浓度范围为176～851 mg/m3，平均浓度为309 mg/m3）可能导致眼睛和上呼吸道刺激反应，以及咳嗽和轻微呼吸道阻塞[12]。而某些无烟碱电子烟PG含量可高达54%，一次抽吸产生的PG浓度可达到430～603 mg/m3[13]。虽然目前文献报道对低浓度PG吸入暴露进行了部分研究，但高浓度的PG长期吸入是否存在更大的安全风险尚未见报道，且电子烟作为长期使用的消费品，其使用过程中长期大剂量吸入PG的安全性也更值得关注。因此，本研究模拟电子烟雾化原理，产生PG气溶胶，对大鼠重复吸入高浓度大剂量的PG进行毒理学研究，为电子烟中PG的应用限值提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1, 2-丙二醇(CAS号：57-55-6，USP级，DOW化学），纯度大于99.9%。Bayer ADVIA120血球分析仪，Hitachi 7020全自动生化分析仪，Sysmex CA1500全自动血凝仪，Clinitek Status尿液分析仪，MICROM STP 120旋转式组织处理机，MICROM EC 350组织包埋处理中心，MICROM HM 315旋转切片机，MICROM HMS 740自动组织切片染色机，IES-N口鼻式吸入暴露系统，高效毛细管气溶胶发生器（自制），CP224S型分析天平，Agilent7890气相色谱仪等。

1.2 试验动物与剂量设置

1.2.1 试验动物及饲养

SPF级Wistar大鼠64只，雌雄各半，6～7周龄，购入后适应性饲养一周。饲养在温度20℃±5℃，相对湿度为50%±20%，12小时光照/黑暗循环的条件下，提供充足的食物和水。本研究符合实验动物福利伦理原则，已通过上海市食品药品检验所实验动物管理和使用委员会的审查，编号为IACUCSIFDC16129。

1.2.2 染毒剂量暴露参数设置

根据预实验结果和相关文献数据，设置三个剂量组剂量分别为100 mg/kg、500 mg/kg、1500 mg/kg。动物的染毒剂量和每分呼吸量（RMV）按照David J.Alexander 等[14]推荐的计算公式计算如下：

药物递送剂量（DD, delivered dose, mg/kg）=气溶胶浓度（mg/L air）× 每分呼吸量（RMV, L/min）×暴露时间（D, duration, min）×（IF）/BW (body weight, kg)

其中IF：药物沉积系数；RMV（L/min）=0.608× BW（g）0.852。

低、中、高剂量组暴露在相同浓度的气溶胶下，通过控制动物暴露时间的长短来控制暴露剂量。在90天的暴露期内，气溶胶的浓度控制在28 mg/L，低、中、高剂量组的初始吸入暴露时间分别为6、27、78 min/天。随着动物体重的增长，按以上推荐公式调整染毒时间以保证染毒剂量的稳定。阴性对照组动物仅鼻部暴露相同气流量的过滤空气，吸入暴露的时间和高剂量组保持一致。

1.2.3 染毒方式及要求

使用毛细管气溶胶发生器（CAG）产生可呼吸PG气溶胶，气溶胶导入到鼻部吸入塔（Raymain Information Technology (Shanghai) Co., LTD）中，共导入8 L/min的稀释气流到暴露塔中，暴露塔有两层，每层8个暴露口，因此每个暴露口的气流量为500 mL/min，将大鼠固定在暴露口进行暴露。在90天的暴露期内，按周期进行动物鼻部吸入暴露口的气溶胶浓度和粒径监测[15-20]。在90天吸入暴露期间，对气溶胶浓度和粒径进行周期性检测，低、中、高剂量组数据显示总体气溶胶浓度范围保持在预设浓度的±6%左右，符合试验要求，发生器的性能较为稳定。相关结果如表1所示。

表1 90天吸入暴露期间PG气溶胶浓度和粒径数据Tab.1 PG aerosol concentration and particle size data during 90-day

1.3 观察指标与方法

在90天鼻部吸入暴露期和恢复期内，所有动物每天密切观察临床症状，包括一般状况观察、刺激性、发病率和死亡率，定期测量动物体重和耗食量。

在第90天暴露期结束和恢复期结束，采用代谢笼收集尿液进行分析，解剖大鼠时，采用20%的乌拉坦腹腔注射麻醉动物，体积为20 mL/kg，麻醉后腹主动脉取血，分别取3 mL、2 mL和3 mL血液进行血常规、血凝和血生化的检测。解剖取材，对取材组织或脏器进行大体观察和称重，然后固定于10%福尔马林固定液（眼球和睾丸固定于Bouin's液）中，常规包埋、切片及染色后进行组织病理学检查。首先对阴性对照组、高剂量组和尸检异常动物进行详细检查，如高剂量组动物某一组织发生病理改变时，再对其他剂量组动物的相同组织进行检查[20]。

1.4 数据处理与统计分析

体重、耗食量、脏器重量及脏器系数及临检的各项数据均用表示，对日常大体观察结果与组织病理学检查的结果，采用半定量的方式或文字表述，以便揭示其与剂量和时间的关系。采用SPSS19.0进行单因素方差分析，对处理组与阴性对照组进行两两比较，并进行组间比较，揭示可能存在的毒性反应的量效关系。

2 结果与分析

2.1 一般观察、体重和耗食量

染毒处理组动物从8～10周起零星出现鼻部出血，但各组间发生率无显著差异，且恢复期内无此现象发生，推测与暴露染毒方式有关；各组动物均精神状态良好，动物的毛色、行为活动、采食、饮水、粪便、呼吸均未见显著异常。暴露期恢复期与阴性对照组相比，在第8周低剂量组雌性动物体重有明显的降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。从第4周起，高剂量组雄性动物的体重明显增长缓慢，并且该趋势持续到恢复期结束，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

由于每个试验组单一性别只有2笼动物，动物笼数量较少，故只列出均值及耗食量变化率，未作统计学分析。与对照组相比，低、高剂量组雌性动物在4周的恢复期内耗食量下降幅度明显，降幅范围达到12.7%～40.8%，其它组别和试验期间耗食量波动较小；低、高剂量组雄性动物在4周的恢复期内耗食量下降幅度明显，降幅范围达到13.9%～35.9%，其它组别和试验期间耗食量波动较小。耗食量恢复期的变化趋势和雄性动物较低的体重增长可能有关，变化趋势详见图1。

图1 90天和恢复期低、中、高剂量组动物体重和耗食量的变化Fig.1 Body weights and food consumption for females and males in each group

2.2 血液生化指标

90天暴露期和恢复期的血生化检查结果显示：与阴性对照组相比，在暴露结束时，高剂量组雄性动物的总蛋白含量和钠离子（Na+）值有轻微的降低（P＜0.05），高剂量组和低剂量组雌性大鼠的钾离子（K+）水平下降（P＜0.05）；与之相反，氯离子（Cl-）水平反而升高（P＜0.05）。恢复期结束后，与阴性对照组相比，中剂量组雄性动物的天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、尿素氮（BUN）和肌酸激酶（CK）值有所升高；中、高剂量组雌性动物尿素氮（BUN）水平升高（P＜0.05），详情见表2和表3。

表2 吸入1,2-丙二醇对雄性大鼠血生化结果的影响（，n=4）Tab.2 Effect of inhaled 1,2-propanediol on blood biochemistry results in male rats（，n=4）

注：与阴性对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与高剂量组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

项目阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量受试物低剂量ALT（IU/L）暴露期 42±4 38±4 38±2 40±4恢复期 38±5 44±2 44±6 46±9 AST/（IU/L）暴露期 121±22 87±19 99±20 126±27恢复期 94±21 108±40 139±19* 124±25 ALP/（IU/L）暴露期 127±29 134±19 150±22 144±8恢复期 99±10 101±10 116±15 111±10 TP/（g/L）暴露期 50.5±0.5 48.8±1.2* 50.6±1.1# 51.9±1.4##恢复期 51.7±1.9 54.1±1.2 53.3±2.3 53.5±0.6 ALB/（g/L）暴露期 25.8±0.4 25.3±0.6 26.1±1.3 25.8±0.8恢复期 25.6±0.3 25.8±1.1 25.4±0.9 25.3±0.1 TBil/（μmol/L）暴露期 1.0±0.0 0.8±0.2 0.9±0.0 1.0±0.1恢复期 1.0±0.2 1.2±0.2 1.1±0.2 1.0±0.2 GLU/（mmol/dL）暴露期 6.63±0.49 6.74±0.59 6.52±0.57 6.78±0.67恢复期 7.44±0.90 7.47±0.98 7.23±0.53 6.93±0.45 BUN/（mmol/L）暴露期 5.31±0.41 5.56±0.25 5.24±0.21 5.46±0.21恢复期 6.07±0.60 6.16±0.33 6.84±0.22* 6.55±0.27 CREA/（μmol/L）暴露期 28.1±2.3 27.6±1.9 28.0±1.8 29.7±3.4恢复期 31.2±1.8 30.6±2.5 32.1±1.4 32.0±1.9 CHO/（mmol/L）暴露期 1.58±0.16 1.52±0.09 1.48±0.07 1.60±0.13恢复期 1.52±0.07 1.55±0.17 1.59±0.12 1.6±0.15 TG/（mmol/L）暴露期 0.42±0.18 0.28±0.09 0.33±0.08 0.42±0.18恢复期 0.42±0.16 0.32±0.01 0.36±0.19 0.36±0.09 CK/（IU/L）暴露期 1332±616 636±412 853±433 1470±729恢复期 882±462 1084±784 1749±308* 1381±370 Na+/（mmol/L）暴露期 143.2±1.3 141.8±0.3* 142.9±0.2 142.6±0.4恢复期 142.2±0.5 142.0±0.8 142.6±0.7 142.2±0.9 K+/（mmol/L）暴露期 4.29±0.54 3.96±0.08 4.29±0.21 4.26±0.33恢复期 4.13±0.24 4.24±0.09 4.27±0.11 4.24±0.06 Cl-/（mmol/L）暴露期 99.2±1.5 101.1±1.4 101.2±1.8 99.9±1.0恢复期 101.8±2.2 101.0±1.6 101.9±1.1 101.0±0.6

表3 吸入1,2-丙二醇对雌性大鼠血生化结果的影响（，n=4）Tab.3 Effect of inhaled 1,2-propanediol on blood biochemisty outcome in female rats（，n=4）

注：与阴性对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

项目阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量受试物低剂量ALT/（IU/L）暴露期 35±5 34±4 32±3 32±2恢复期 36±2 34±4 38±3 33±4 AST/（IU/L）暴露期 142±29 131±35 139±13 145±27恢复期 129±34 133±11 143±36 149±50 ALP/（IU/L）暴露期 78±12 77±6 79±11 69±5恢复期 43±5 46±1 45±3 44±3 TP/（g/L）暴露期 50.3±0.4 50.4±1.9 50.2±0.9 50.4±0.5恢复期 53.0±2.0 53.5±0.8 54.3±2.6 55.0±1.7 ALB/（g/L）暴露期 27.8±0.3 27.4±0.6 28.0±1.0 27.8±0.4恢复期 27.8±0.6 27.3±0.6 27.8±1.1 27.7±0.8 TBil/（μmol/L）暴露期 1.0±0.3 0.9±0.2 1.0±0.1 0.8±0.3恢复期 1.2±0.4 0.8±0.1* 0.9±0.3 0.9±0.1 GLU/（mmol/dL）暴露期 5.37±1.05 5.72±0.14 5.48±0.56 5.78±0.46恢复期 5.28±0.76 6.02±0.32 5.74±0.70 5.77±0.48 BUN/（mmol/L）暴露期 5.71±0.30 5.91±0.91 6.10±0.44 5.92±0.28恢复期 5.66±0.43 6.66±0.82* 6.66±0.28* 5.96±0.37 CREA/（μmol/L）暴露期 37.3±5.2 33.5±4.5 37.9±3.3 34.9±2.9恢复期 36.1±5.2 33.7±1.9 37.2±3.5 36.1±3.0 CHO/（mmol/L）暴露期 1.90±0.08 1.85±0.23 1.96±0.22 1.90±0.34恢复期 2.03±0.20 2.15±0.22 2.22±0.11 1.99±0.13 TG/（mmol/L）暴露期 0.37±0.04 0.29±0.06 0.34±0.10 0.33±0.02恢复期 0.33±0.04 0.29±0.05 0.34±0.04 0.35±0.04 CK/（IU/L）暴露期 1639±533 1514±668 1644±204 1919±741恢复期 1509±601 1711±147 1890±962 2118±1035 Na+/（mmol/L）暴露期 141.0±1.9 142.6±1.0 140.9±1.1 141.4±1.1恢复期 142.7±1.3 141.8±0.8 142.0±1.0 142.4±0.5 K+/（mmol/L）暴露期 4.84±0.44 4.28±0.25* 4.39±0.15 4.33±0.30*恢复期 4.00±0.39 4.07±0.06 4.22±0.40 4.15±0.32 Cl-/（mmol/L）暴露期 100.3±1.2 102.5±0.9* 100.6±1.2 102.2±0.9*恢复期 102.6±1.4 101.9±1.1 102.0±1.0 102.1±0.9

2.3 血液学指标

暴露期和恢复期的血液学检查结果显示：与阴性对照组相比，暴露结束时，高剂量组雄性动物红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）和血容比（HCT）、中剂量组雄性动物RBC显著降低（P＜0.05或P＜0.01），且与高剂量组相比，中、低剂量组的红细胞数存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）；低剂量组的雌性动物的白细胞（WBC）和淋巴细胞（Lymph）也显著降低（P＜0.05），但相关指标在恢复期间恢复正常。其它血液学指标上未显示出剂量相关性的显著性变化，详情见表4和表5。

表4 吸入1,2-丙二醇对雄性大鼠血液学结果的影响（，n=4）Tab.4 Effect of inhaled 1,2-propanediol on hematology results in male rats（，n=4）

注：由于血球仪仪器试剂不够但仪器未报警，部分指标未检测出。与阴性对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，与高剂量组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

±s，n=4）项目阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量受试物低剂量WBC（×109/L）暴露期 3.37±0.83 2.58±0.33 3.26±0.83 3.64±0.32恢复期 2.395±0.19 3.18±1.36 4.32±1.39 4.08±0.96 RBC（×1012/L）暴露期 8.17±0.15 7.60±0.13** 7.90±0.24*# 8.11±0.13##恢复期 8.50±0.30 8.72±0.46 8.85±0.33 8.58±0.42 HGB（g/dL）暴露期 16.5±0.6 15.5±0.5* 16.0±0.5 16.1±0.2恢复期 15.4±0.4 16.0±0.9 16.1±0.4 15.6±0.3 HCT（%）暴露期 42.3±2.4 39.2±0.7* 40.6±1.1 41.2±0.8恢复期 43.9±1.6 45.4±2.5 45.9±1.2 44.1±2.0 MCV（fL）暴露期 51.8±1.9 51.6±0.5 51.4±0.5 50.9±0.3恢复期 51.6±1.0 52.0±0.3 51.8±0.6 51.4±0.2 MCH（pg）暴露期 20.2±0.3 20.4±0.7 20.2±0.3 20.0±01恢复期 18.2±0.2 18.4±0.5 18.2±0.8 18.2±0.6 MCHC（g/dL）暴露期 39.0±0.8 39.5±1.6 39.2±0.6 39.0±0.4恢复期 35.2±0.3 35.2±0.9 35.1±1.2 35.3±1.0 PLT（×109/L）暴露期 890±147 834±100 844±65 959±33恢复期 988±88 1076±89 1071±52 1028±30 Neut（×109/L）暴露期 1.31±0.51 0.87±0.19 0.99±0.26 1.25±0.31恢复期 / / / /Lymph（×109/L）暴露期 1.83±0.60 1.57±0.16 2.10±0.53 2.21±0.42恢复期 1.81±0.12 1.82±0.78 2.38±0.36 2.13±0.44 Mono（×109/L）暴露期 0.07±0.03 0.06±0.02 0.07±0.04 0.07±0.02恢复期 0.06±0.02 0.08±0.05 0.10±0.03 0.10±0.02 Eos（×109/L）暴露期 0.15±0.14 0.07±0.02 0.08±0.02 0.10±0.02恢复期 / / / /Baso（×109/L）暴露期 0.02±0.01 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.01恢复期 / / / /Retic（×109/L）暴露期 172.8±15.3 165.2±27.5 164.1±11.1 175.2±14.4恢复期 / / / /APTT（sec）暴露期 17.4±0.8 16.5±1.2 15.7±3.1 16.6±1.2恢复期 18.7±0.8 17.1±2.3 16.6±0.4* 16.7±0.7*Fbg（g/L）暴露期 8.2±0.7 8.5±0.5 8.5±0.2 8.0±0.3恢复期 10.4±0.9 8.7±0.5** 8.0±0.9** 8.2±0.3**PT（sec）暴露期 8.2±0.2 8.3±0.2 8.0±0.3 8.2±0.1恢复期 8.2±0.2 8.4±0.2 8.4±0.1 8.4±1.0 TT（sec）暴露期 58.5±3.0 56.3±3.4 55.8±9.2 58.0±5.5恢复期 54.5±2.1 56.8±5.4 58.4±3.9 58.4±5.4（x

表5 吸入1, 2-丙二醇对雌性大鼠血液学结果的影响（，n=4）Tab.5 Effect of inhaled 1, 2-propanediol on hematology results in female rats（，n=4）

注：由于血球仪仪器试剂不够但仪器未报警，部分指标未检测出。与阴性对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，与高剂量组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

（x±s，n=4）项目阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量受试物低剂量WBC（×109/L）暴露期 2.91±0.83 2.50±0.23 2.54±0.44 1.74±0.42**恢复期 2.10±0.96 1.73±0.15 1.74±0.77 1.75±0.42 RBC（×1012/L）暴露期 7.33±0.35 7.40±0.19 7.26±0.18 7.42±0.52恢复期 7.85±0.31 7.83±0.14 7.86±0.16 7.44±0.60 HGB（g/dL）暴露期 16.5±0.5 16.3±0.3 16.0±0.4 16.4±1.1恢复期 15.6±0.6 15.6±0.3 15.8±0.2 15.3±0.7 HCT（%）暴露期 39.8±2.7 40.1±1.2 39.1±0.9 40.6±2.3恢复期 43.4±1.4 43.1±0.8 43.7±0.9 40.9±3.6 MCV（fL）暴露期 54.2±1.3 54.1±0.8 53.8±0.2 54.7±1.2恢复期 55.4±0.7 55.1±0.1 55.6±1.0 54.9±0.8 MCH（pg）暴露期 22.6±1.7 22.0±0.2 22.0±0.3 22.0±0.1恢复期 19.9±0.2 20.0±0.3 20.0±0.1 20.7±1.6 MCHC（g/dL）暴露期 41.6±4.1 40.6±0.5 40.9±0.5 40.4±0.8恢复期 36.0±0.8 36.3±0.5 36.0±0.6 37.7±2.9 PLT（×109/L）暴露期 846±106 864±55 882±110 881±71恢复期 962±57 977±144 905±142 1043±152 Neut（×109/L）暴露期 0.82±0.41 0.65±0.03 0.78±0.19 0.49±0.22恢复期 / / / /Lymph（×109/L）暴露期 1.95±0.60 1.68±0.21 1.64±0.24 1.16±0.24**恢复期 1.30±0.87 1.10±0.25 1.08±0.46 1.10±0.37 Mono（×109/L）暴露期 0.05±0.02 0.05±0.01 0.04±0.02 0.04±0.02恢复期 0.03±0.02 0.02±0.01 0.03±0.01 0.03±0.01 Eos（×109/L）暴露期 0.07±0.02 0.10±0.08 0.05±0.00 0.04±0.02恢复期 / / / /Baso（×109/L）暴露期 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00恢复期 / / / /Retic（×109/L）暴露期 175.1±51.5 170.8±19.0 180.4±16.9 159.2±36.9恢复期 228.7±7.5 198.4±10.5* 216.7±17.7 220.9±36.6 APTT（sec）暴露期 18.9±1.0 18.2±0.8 15.6±3.1* 16.2±1.0恢复期 18.5±2.9 18.2±1.1 18.5±0.6 19.7±4.0 Fbg（g/L）暴露期 9.3±0.8 9.6±0.8 9.5±0.7 9.6±0.7恢复期 9.8±0.3 9.7±0.3 9.3±0.2* 10.1±0.2 PT（sec）暴露期 7.7±0.1 7.7±0.1 7.6±0.4 7.6±0.1恢复期 8.2±0.5 8.0±0.2 8.0±0.4 8.1±0.1 TT（sec）暴露期 53.1±2.3 53.8±1.6 49.0±6.3 51.8±0.8恢复期 54.4±3.7 56.0±2.1 55.8±3.0 51.6±8.3

2.4 尿液指标

暴露期与恢复期结束后，对试验大鼠的尿液中的尿糖、尿蛋白、尿胆红素、尿胆原、酮体、潜血、白细胞、尿亚硝酸盐、比重和pH值等指标进行检测，与阴性对照组相比，尿胆原和pH值各剂量未出现显著性差异；剩余指标为描述性指标，结果均为正常或阴性，详情见表6和表7。

2.5 脏器重量及脏器系数

暴露结束后解剖大鼠称重脏器结果显示，与阴性对照组相比，高剂量组雄性大鼠睾丸的脏体比明显升高（P＜0.05），其余各脏器重量和脏器系数未见显著差异（P＞0.05）。

在恢复期结束剖检发现，与阴性对照组相比，中剂量组雌性大鼠胸腺重量增加（P＜0.05），胸腺的脏脑比系数显著升高（P＜0.05），高剂量组雌性动物肾脏脏体比明显升高（P＜0.05）。除以上发现以外，其余各脏器重量和脏器系数未见显著差异（P＞0.05），详情见表8至表13。

表6 吸入1,2-丙二醇对雄性大鼠尿液的影响（x± s，n=4）Tab.6 Effect of inhaled 1,2-propanediol on urine of male rats（，n=4）

受试物低剂量URO 暴露期 3.2±0.0 3.2±0.0 3.2±0.0 3.2±0.0恢复期 3.2±0.0 3.2±0.0 3.2±0.0 3.2±0.0 PH 暴露期 6.7±0.3 6.9±0.2 6.8±0.3 6.9±0.2恢复期 6.8±0.3 6.9±0.2 6.8±0.3 6.9±0.2指标阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量

表7 吸入1,2-丙二醇对雌性大鼠尿液的影响（x ±s，n=4）Tab.7 Effect of inhaled 1,2-propanediol on urine of female rats（，n=4）

受试物低剂量URO 暴露期 3.2±0.0 3.2±0.0 3.2±0.0 3.2±0.0恢复期 3.2±0.0 3.2±0.0 3.2±0.0 3.2±0.0 PH 暴露期 6.9±0.2 6.6±0.2 7.1±0.9 6.5±0.0恢复期 6.9±0.2 6.6±0.2 7.1±0.9 6.5±0.0指标阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量

表8 吸入1,2-丙二醇对雄性动物脏器重量的影响（，n=4）Tab.8 Effects of inhaled 1,2-propanediol on the organ weight of male animals（，n=4）

注：与阴性对照组相比 * P＜0.05，** P＜0.01。

脏器阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量受试物低剂量脑暴露期 1.8979±0.0562 1.8706±0.0846 1.8543±0.0575 1.9148±0.0245心脏暴露期 1.0777±0.0427 1.0050±0.0738 1.0608±0.0374 1.0710±0.0422肝脏暴露期 8.7802±0.2853 7.9548±0.7126 8.5267±0.6085 8.9099±0.3039肾脏暴露期 2.2178±0.0823 2.0874±0.1391 2.1673±0.0096 2.2374±0.1420肺暴露期 1.2570±0.0362 1.1864±0.1701 1.2493±0.0881 1.2199±0.0197脾脏暴露期 0.6060±0.0263 0.6120±0.0338 0.6090±0.0530 0.6317±0.0270肾上腺暴露期 0.0568±0.0070 0.0549±0.0072 0.0575±0.0044 0.0561±0.0046胸腺暴露期 0.3101±0.0357 0.2606±0.0591 0.2777±0.0415 0.2744±0.0332睾丸暴露期 3.2225±0.1883 3.2408±0.2234* 3.2547±0.1073 3.1858±0.0946附睾暴露期 1.1257±0.0753 1.0334±0.0807 1.0952±0.0769 0.9970±0.1124脑恢复期 1.9233±0.0344 1.9143±0.0228 1.9297±0.0569 1.9280±0.0424心脏恢复期 1.1347±0.0705 1.1544±0.0575 1.2001±0.0733 1.1619±0.0510肝脏恢复期 9.9788±0.8817 9.5004±0.5167 10.3957±1.23766 10.1073±0.2689肾脏恢复期 2.3200±0.1403 2.2989±0.1595 2.4070±0.1482 2.4138±0.1166肺恢复期 1.2939±0.1066 1.3064±0.0942 1.3816±0.0785 1.2577±0.0773脾脏恢复期 0.7236±0.0328 0.6985±0.0869 0.6882±0.0690 0.7341±0.0265肾上腺恢复期 0.0503±0.0025 0.0491±0.0054 0.0488±0.0058 0.0566±0.0119胸腺恢复期 0.2800±0.0524 0.2857±0.0242 0.3078±0.0514 0.2842±0.0537睾丸恢复期 3.3172±0.2136 3.3534±0.1695 3.3367±0.1947 3.2456±0.2309附睾恢复期 1.1033±0.0436 1.1071±0.0614 1.0517±0.0267 1.1432±0.1702

表9 吸入1, 2-丙二醇对雌性动物脏器重量的影响（，n=4）Tab.9 Effects of inhaled 1, 2-propanediol on the organ weight of female animals （，n=4）

注：与阴性对照组相比 * P＜0.05，** P＜0.01。

脏器阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量受试物低剂量脑暴露期 1.7733±0.0482 1.7780±0.0205 1.6398±0.2579 1.7544±0.0565心脏暴露期 0.7438±0.0466 0.7483±0.0545 0.9532±0.4589 0.7162±0.0588肝脏暴露期 5.3105±0.1747 5.4096±0.3885 5.4256±0.5378 5.2228±0.3575肾脏暴露期 1.4450±0.0965 1.4816±0.0325 1.4081±0.0706 1.4112±0.0746肺暴露期 0.9598±0.1047 0.9578±0.0478 0.9158±0.0207 0.9064±0.0251脾脏暴露期 0.4544±0.0402 0.4788±0.0265 0.4620±0.0317 0.4515±0.0165肾上腺暴露期 0.0579±0.0056 0.0618±0.0022 0.0608±0.0037 0.0589±0.0069胸腺暴露期 0.2784±0.0442 0.2655±0.0111 0.2467±0.0063 0.2445±0.0142卵巢暴露期 0.0887±0.0120 0.0888±0.0069 0.0824±0.0170 0.0853±0.0105子宫暴露期 0.2938±0.0431 0.2992±0.0672 0.3863±0.0691 0.3002±0.0102脑恢复期 1.7638±0.0365 1.7907±0.0526 1.7578±0.0272 1.7629±0.0627心脏恢复期 0.7634±0.0563 0.7864±0.0441 0.7459±0.0391 0.7801±0.0473肝脏恢复期 5.6823±0.2270 6.0454±0.3936 5.6112±0.2219 5.737±0.3172肾脏恢复期 1.4508±0.0604 1.5758±0.1130 1.4696±0.0523 1.4300±0.0219肺恢复期 1.1291±0.3659 1.0108±0.0613 1.0392±0.0831 0.9715±0.0427脾脏恢复期 0.4831±0.0388 0.4904±0.0077 0.4750±0.0064 0.4669±0.0264肾上腺恢复期 0.0551±0.0043 0.0603±0.0046 0.0558±0.0088 0.0603±0.0020胸腺恢复期 0.2521±0.0133 0.2774±0.0192 0.2907±0.0250** 0.2514±0.0171卵巢恢复期 0.0996±0.0111 0.0984±0.0176 0.0873±0.0059 0.0991±0.0139子宫恢复期 0.3854±0.0630 0.3430±0.0757 0.3569±0.0944 0.4697±0.0391

表10 吸入1,2-丙二醇对雄性动物脏体比的影响（，n=4，g/100g 体重）Tab.10 Effect of inhaled 1,2-propanediol on the viscera-body ratio of male animals（，n=4, g/100g body weight）

注：与阴性对照组相比 * P＜0.05，** P＜0.01。

脏器/体重阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量受试物低剂量脑暴露期 0.5650±0.0283 0.6407±0.0943 0.5618±0.0494 0.5495±0.0215心脏暴露期 0.3206±0.0135 0.3436±0.0486 0.3206±0.0110 0.3073±0.0164肝脏暴露期 2.6124±0.0936 2.7075±0.2708 2.5754±0.1611 2.5546±0.0225肾脏暴露期 0.6596±0.0152 0.7124±0.0841 0.6549±0.0297 0.6427±0.0568肺暴露期 0.3740±0.0111 0.4023±0.0418 0.3769±0.0063 0.3502±0.0174脾脏暴露期 0.1802±0.0021 0.2093±0.0280 0.1838±0.0130 0.1815±0.0144肾上腺暴露期 0.0170±0.0027 0.0191±0.0057 0.0174±0.0016 0.0161±0.0019胸腺暴露期 0.0924±0.0125 0.0890±0.0204 0.0836±0.0096 0.0786±0.0082睾丸暴露期 0.9592±0.0481 1.1053±0.1219* 0.9844±0.0589 0.9147±0.0523附睾暴露期 0.3353±0.0294 0.3540±0.0568 0.3314±0.0312 0.2868±0.0408脑恢复期 0.5125±0.0307 0.5368±0.0150 0.5038±0.0302 0.5020±0.0204心脏恢复期 0.3017±0.0110 0.3234±0.0080* 0.3130±0.0185 0.3023±0.0101肝脏恢复期 2.6523±0.1668 2.6620±0.1047 2.6986±0.0976 2.6302±0.0641肾脏恢复期 0.6171±0.0274 0.6437±0.0229* 0.6277±0.0382 0.6285±0.0368肺恢复期 0.3448±0.0341 0.3660±0.0204 0.3602±0.0183 0.3278±0.0282脾脏恢复期 0.1925±0.0056 0.1953±0.0174 0.1790±0.0083 0.1911±0.0076肾上腺恢复期 0.0134±0.0008 0.0138±0.0013 0.0127±0.0012 0.0147±0.0028胸腺恢复期 0.0741±0.0110 0.0802±0.0087 0.0801±0.0120 0.0739±0.0134睾丸恢复期 0.8834±0.0677 0.9395±0.0294 0.8731±0.0959 0.8442±0.0518附睾恢复期 0.2936±0.0113 0.3102±0.0114 0.2751±0.0258 0.2968±0.0376

表11 吸入1,2-丙二醇对雌性动物脏体比的影响（，n=4，g/100g 体重）Tab.11 Effect of inhaled 1,2-propanediol on the viscera-body ratio of female animals（，n=4, g/100g body weight）

注：与阴性对照组相比 * P＜0.05，** P＜0.01。

脏器/体重阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量受试物低剂量脑暴露期 0.8394±0.0497 0.8627±0.0352 0.8227±0.15303 0.8544±0.0109心脏暴露期 0.3514±0.0118 0.3626±0.0190 0.4860±0.2680 0.3486±0.0233肝脏暴露期 2.5121±0.1149 2.6197±0.1049 2.7038±0.1890 2.5416±0.1119肾脏暴露期 0.6834±0.0475 0.7186±0.0261 0.7028±0.0252 0.6870±0.0240肺暴露期 0.4523±0.0240 0.4652±0.0381 0.4577±0.0231 0.4415±0.0078脾脏暴露期 0.2150±0.0198 0.2324±0.0177 0.2305±0.0095 0.2199±0.0067肾上腺暴露期 0.0273±0.0010 0.0300±0.0020 0.0304±0.0018 0.0286±0.0030胸腺暴露期 0.1312±0.0163 0.1289±0.0093 0.1234±0.0085 0.1192±0.0087卵巢暴露期 0.0420±0.0066 0.0432±0.0047 0.0411±0.0081 0.0416±0.0054子宫暴露期 1.400±0.0288 0.1459±0.0380 0.1926±0.0317 0.1463±0.0071脑恢复期 0.8075±0.0227 0.8144±0.0311 0.7848±0.0267 0.8002±0.0496心脏恢复期 0.3495±0.0271 0.3577±0.0234 0.3326±0.0076 0.3536±0.0181肝脏恢复期 2.6001±0.0601 2.7518±0.0254 2.5040±0.0780 2.5996±0.0792肾脏恢复期 0.6643±0.0336 0.7154±0.0254* 0.6556±0.0083 0.6487±0.0208肺恢复期 0.5182±0.1750 0.4594±0.0233 0.4640±0.0398 0.4408±0.0246脾脏恢复期 0.2210±0.0159 0,2232±0.1212 0.2122±0.0122 0.2116±0.0078肾上腺恢复期 0.0252±0.0019 0.0274±0.0012 0.0249±0.0037 0.0274±0.0016胸腺恢复期 0.1154±0.0062 0.1263±0.0121 0.1296±0.0097 0.1142±0.0113卵巢恢复期 0.0456±0.0059 0.0447±0.0075 0.0390±0.0022 0.0448±0.0052子宫恢复期 0.1764±0.0291 0.1577±0.0456 0.1602±0.0479 0.2135±0.0243

表12 吸入1,2-丙二醇对雄性动物脏脑比的影响（，n=4，g/g）Tab.12 Effect of inhaled 1,2-propanediol on viscera-brain ratio in male animals （，n=4, g/g）

注：与阴性对照组相比 * P＜0.05，** P＜0.01。

脏器/脑阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量受试物低剂量心脏暴露期 0.5678±0.0132232 0.5368±0.0182 0.5730±0.0369 0.5596±0.0285肝脏暴露期 4.6289±0.193535 4.2462±0.2013 4.6082±0.4617 4.6536±0.1659肾脏暴露期 1.1670±0.0718 1.1152±0.0324 1.1706±0.0854 1.1681±0.0628肺暴露期 0.6625±0.0158 0.6322±0.0617 0.6753±0.0686 0.6372±0.0160脾脏暴露期 0.3196±0.0181 0.3272±0.0052 0.3290±0.0346 0.3300±0.0165肾上腺暴露期 0.0299±0.0034 0.0294±0.0043 0.0310±0.0029 0.0293±0.0027胸腺暴露期 0.1638±0.0225 0.1396±0.0321 0.1503±0.0267 0.1434±0.0184睾丸暴露期 1.6992±0.0821 1.7319±0.0775 1.7567±0.0845 1.6640±0.0548附睾暴露期 0.5938±0.0484 0.5528±0.0426 0.5909±0.0426 0.5212±0.0640心脏恢复期 0.5898±0.0321 0.6028±0.0240 0.6221±0.0381 0.6028±0.0260肝脏恢复期 5.1908±0.4886 4.9609±0.2136 5.3786±0.5009 5.2456±0.2214肾脏恢复期 1.2068±0.0825 1.2006±0.0776 1.2472±0.0640 1.2523±0.0636肺恢复期 0.6732±0.0618 0.6826±0.0512 0.7162±0.0396 0.6525±0.0410脾脏恢复期 0.3763±0.0183 0.3647±0.0434 0.3563±0.0285 0.3810±0.0180肾上腺恢复期 0.0262±0.0012 0.0256±0.0026 0.0253±0.0031 0.0294±0.0060胸腺恢复期 0.1456±0.0269 0.1492±0.0126 0.1592±0.0244 0.1472±0.0268睾丸恢复期 1.7243±0.0972 1.7512±0.0694 1.7296±0.1005 1.6830±0.1051附睾恢复期 0.5736±0.0175 0.5781±0.0258 0.5454±0.0203 0.5931±0.0887

表13 吸入1,2-丙二醇对雌性动物脏脑比的影响（，n=4, g/g）Tab.13 Effect of inhaled 1,2-propanediol on viscera-brain ratio in female animals（，n=4, g/g）

注：与阴性对照组相比 * P＜0.05，** P＜0.01。

脏器/脑阶段阴性对照受试物高剂量受试物中剂量受试物低剂量心脏暴露期 0.4196±0.0272 0.4211±0.034141 0.5863±0.2673 0.4081±0.0277肝脏暴露期 2.9945±0.0431 3.0427±0.2173 3.3762±0.6674 2.9746±0.1179肾脏暴露期 0.8142±0.0341 0.8333±0.0131 0.8773±0.1656 0.8042±0.0271肺暴露期 0.5410±0.0543 0.5388±0.0263 0.5703±0.1019 0.5168±0.0104脾脏暴露期 0.2561±0.0185 0.2692±0.0128 0.2880±0.0576 0.2574±0.0054肾上腺暴露期 0.0326±0.0027 0.0348±0.0010 0.0378±0.0062 0.0336±0.0036胸腺暴露期 0.1573±0.0262 0.1493±0.0052 0.1534±0.0251 0.1396±0.0115卵巢暴露期 0.0501±0.0075 0.0500±0.0040 0.0508±0.0102 0.0487±0.0066子宫暴露期 0.1661±0.0276 0.1685±0.0392 0.2441±0.0786 0.1714±0.0103心脏恢复期 0.4325±0.0244 0.4392±0.0208 0.4242±0.0193 0.4435±0.0404肝脏恢复期 3.2214±0.1032 3.3778±0.2295 3.1922±0.1137 3.2612±0.2880肾脏恢复期 0.8224±0.0226 0.8795±0.0470* 0.8359±0.0191 0.8118±0.0264肺恢复期 0.6390±0.2000 0.5644±0.0290 0.5912±0.0448 0.5513±0.0238脾脏恢复期 0.2742±0.0258 0.2740±0.0040 0.2703±0.0068 0.2654±0.0232肾上腺恢复期 0.0312±0.0023 0.0336±0.0017 0.0317±0.0048 0.0342±0.0019胸腺恢复期 0.1430±0.0084 0.1551±0.0130 0.1654±0.0137** 0.1426±0.0068卵巢恢复期 0.0566±0.0073 0.0549±0.0091 0.0496±0.0027 0.0565±0.0010子宫恢复期 0.2189±0.0390 0.1924±0.0478 0.2036±0.0573 0.2664±0.0196

2.6 组织病理学检查

肺组织病理结果如表14所示，对照组和高剂量组肺部病理变化的发生率和程度较为类似，包括血管或血管周围炎症和轻微的胸膜下肺泡肉芽肿（3/8）。在高剂量组中观察到肺中泡沫状细胞的扩散存在，而对照组的主要发现是肺泡巨噬细胞。在恢复期，肺损伤中最显着的发现是对照组（4/8）和高剂量组（6/8）中的炎性细胞浸润，间质和肺泡水肿，血管充血和肺泡塌陷，结果无性别差异。组间鼻腔、气管、喉组织形态均无异常。

其它神经、内分泌、循环、淋巴和血液等系统均未发现明显病理变化，但消化、泌尿和生殖系统观察到有轻微改变，如暴露结束后，阴性对照组和高剂量组观察到肝细胞点状坏死（1/8，1/8），阴性对照组动物肾小管嗜碱性变化和间质性炎症细胞浸润（2/8）等；在恢复期结束后，高剂量组观察到胰岛细胞增生（2/8）；阴性对照组和高剂量组恢复期显示良性肿瘤乳腺增生和阴道炎（1/4，1/4）等。

表14 90天吸入毒性大鼠肺部组织病理学检测结果Tab.14 Pathological examination results of pulmonary tissue for rats with 90-day inhalation

图2 90天吸入毒性大鼠部分肺部组织病理切片Fig.2 Pathological section of pulmonary tissue for rats with 90-day inhalation

3 讨论

PG作为电子烟的一种雾化剂，其长期和高剂量吸入引起了大家对其安全性的关注和担忧。目前有几篇文献报道了吸入PG气溶胶的毒性和安全性研究[8-10]，然而由于当时仪器装置的限制，无法进行高浓度下的暴露研究，或者部分研究的暴露时间不够长。因此本研究进行了90天亚慢性吸入高浓度PG气溶胶的安全性评价试验，使用了自主研制CAG发生器，它可以产生出1 µm～2 µm粒径的微细粒子，同时可以提供较高浓度的气溶胶。

对于慢性吸入毒性来说，气溶胶的浓度和暴露时间是至关重要的。Pauluhn研究[21]报道说，在解释大鼠急性和慢性吸入亚甲基二苯基二异氰酸酯（MDI）模型中，用辅助计算机毒理学来计算，与仅以气溶胶浓度或由时间计算的累积剂量相比，C（气溶胶浓度mg/L）×T（暴露时间day）相对急性肺部刺激阈值对于慢性毒性结果来说，更有决定性意义。由此假设，对于亚慢性吸入PG气溶胶来说，不仅累积吸入剂量，而且气溶胶浓度和吸入暴露时间都会对其毒性产生影响。因此采用3种方式去考虑其毒性：1）递送剂量（mg/kg）；2）暴露浓度；3）C×T。考虑到暴露浓度对于毒性的影响，预设的气溶胶浓度大约是所有暴露状况中，最大暴露浓度的30倍。据报道，电子烟气溶胶的暴露浓度有430 mg/m3～603 mg/m3[13]和1 mg/L[22]。因此，本研究预设的气溶胶浓度应当满足充分暴露的需求，有可能引起眼部或鼻部刺激反应，甚至有可能对呼吸道产生影响。

加热和形成气溶胶的过程，可以产生1 µm～ 2 µm可吸入的微细粒子。通过调节和监控加在PG液体上的能量，防止PG热解反应产生副产物从而引起毒副反应。通过对PG气溶胶浓度和粒径的监测数据可看出，在选择的条件下吸入PG气溶胶可以达到肺部深度沉积，并且有可达30%～50% 的肺部沉积率[23-24]。为了保守起见，在剂量计算的时候，采用10%的吸入系数IF。在吸入试验中，最为常见和显著的反应是喉部的损伤，对于大多数吸入物质都会产生此反应，因此被认定为是大鼠物种特有的呼吸道结构导致的。本试验中组织病理学检查没有发现喉部损伤，但是临床观察发现鼻部出血和眼周分泌物增多等症状。吸入物质对于鼻部的刺激在很多吸入研究的文献中都有被报道过[25-27]，也有文献报道了吸入PG气溶胶的研究[9,28]，可知有刺激性的反应，包括鼻腔和喉部极微到轻度鼻嗅上皮细胞坏死，甚至会有轻度到中度喉部鳞状上皮化生，这些也都被认为是大鼠物种特有的适应性反应[28-30]。本研究中的临床观察发现，在组织病理学上都没有表现，并且在恢复期内完全恢复。鼻部和眼周极微到轻度的出血反应是由于PG的吸湿性使其发挥脱水的作用，从而破坏鼻部粘膜的代偿作用，这种刺激性机制属于大鼠物种特异性粘膜防御机制[21]。雌/雄性动物出现类似的体重减少和耗食量减少的情况，推测可能是吸入PG气溶胶有抑制动物胃口的作用，对动物的日常活动和行为也有影响。

血液学和临床生化分析只出现了个别零星的有统计学差异的变化，并且都在正常值范围内，加之病理形态学检查，更加验证了不管是口服途径摄入PG还是吸入途径摄入PG气溶胶都没有系统毒性产生。雄性动物的RBC、HGB和HCT值有轻微的降低，且有剂量相关性，然而雌性动物只有低剂量组WBC和淋巴细胞略有减少。所有的有统计学差异的数据都在同来源、同品系、同性别大鼠的正常值范围内，因此这些变化是没有生物学意义的，也不认为是毒副反应。参考通过吸入途径或气管内滴注途径来研究PG对呼吸系统的影响的报道[7,9,28]，认为PG气溶胶可能对呼吸系统有一定的刺激性。在最近一篇关于电子烟毒性的研究中[22]，溶剂对照组是PG和丙三醇气溶胶混合溶液，文中强调电子烟使用的溶剂有可能造成肺部损伤。总之，在血液学和临床生化的检测上，无组织形态学的变化或剂量依赖的关系。因此，保守起见根据动物体重、耗食量和血液学的数据定义90天大鼠吸入PG气溶胶的NOEL值为100 mg/kg。