嗜麦芽寡养单胞菌J03对烤烟二氯喹啉酸药害的修复作用

周挺，郭学清，田佩玉，陈凤平，顾钢

1 福建省烟草公司，烟草科学研究所，福建福州北环中路133号 350003；2 福建省龙岩市烟草公司，长汀分公司，福建长汀汀州镇环城中路25号 366300；3 福建农林大学，植物病毒研究所，福建福州上下店路15号 350002

二氯喹啉酸是德国巴斯夫公司上世纪80年代生产的一种激素型喹啉酸类除草剂，是防除稻田稗草的特效选择性除草剂，具有良好的除草效果和较长的持效期[1]，在稻田使用普遍。已有研究表明二氯喹啉酸在土壤中残留量较大，半衰期长，易对后茬作物产生药害[2-3]。

我国南方烟区多实行水旱轮作，即烟－稻轮作的耕作模式，连年种烟导致土壤酸化，在pH＜4.5的环境中，前茬水稻施用的二氯喹啉酸残留较易以分子形式通过烟株质膜在体内富集[4]，二氯喹啉酸可通过抑制土壤中和烟株体内的酶活性，导致烤烟在生长中发生畸形、变黄等药害症状[5-6]。发生药害的烟株，叶片发生畸形，变窄变厚，不能伸展，叶宽受到抑制，边缘向叶背翻转皱缩，严重时出现线状或鼠尾状叶型[7]。广东烟区曾报道稻田施用二氯喹啉酸引起大面积后茬烤烟烟叶畸形[8]。福建烟区近年也时常出现除草剂残留危害烤烟的情况。

二氯喹啉酸在田间的降解与多种因素有关。其在稻田水中的主要消解途径是光解，与光照和光氧化酶有关[9]；在土壤中消解动态与土壤种类、结构、酸碱度、微生物等有关[2]。二氯喹啉酸在碱性、质地疏松的土壤中，其消解速度较酸性、质地紧密的土壤中快[10]。土壤湿度通过影响二氯喹啉酸的可溶性和活性，从而影响其降解速率[11]。已有研究表明，自然界中存在的微生物是环境中二氯喹啉酸残留降解的重要因素。研究人员从不同环境中分离获得了一些可降解二氯喹啉酸的细菌，包括博德特氏菌属（Bordetella sp.）细菌[12]、产碱菌属（Alcaligenessp．）细菌[13]、 泛菌属（Pantoea sp.） 细菌[14]、 节 秆菌属（Arthrobacter sp.）细菌[15]、分支杆菌属（Mycobacterium sp.）细菌[16]、链霉菌属（Streptomyces sp.）细菌[17]等。部分菌株已被证明对烤烟二氯喹啉酸药害具有一定修复作用[18-19]。本文从福建省龙岩市长汀县植烟土壤中富集分离二氯喹啉酸降解菌并进行鉴定；同时，开展温室盆栽及田间小区试验研究该菌株对受害烟草的修复能力，为解决南方烟区水旱轮作烟田二氯喹啉酸残留危害问题提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

土样：采自福建省龙岩市长汀县近年发生过二氯喹啉酸药害的烟田耕作层土壤；

无机盐培养基[20]：MgSO4∙7H2O 0.2 g/L, KH2PO41.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，(NH4)2SO40.5 g/L, CaCl20.01 g/L，FeSO4trace，NaNO30.5 g/L，调节pH至7-7.5；

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L；

二氯喹啉酸标准品（99.9%）：沈阳化工研究院；

50%二氯喹啉酸可湿性粉剂：江苏省激素研究所股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 二氯喹啉酸降解菌的分离

称取0.1 g土样与100 mL 液体无机盐培养基混合，加入二氯喹啉酸使其终浓度为100 µg/mL，30℃条件下，150 r/min培养7 d；取培养液1 mL加入100 mL含同样浓度二氯喹啉酸的新鲜培养基中，同时于固体无机盐培养基划线以确认有细菌生长，同样条件培养7 d；连续继代培养10次后，经平板划线分离，获得单菌落菌株J03。

1.2.2 J03菌株Biolog代谢芯片鉴定

参照使用说明书，采用Biolog GEN Ⅲ测定J03菌株的碳源利用，接种48 h 后通过Biolog MicrostationTM全自动细菌鉴定程序读取数据，记录结果。

1.2.3 J03菌株的系统发育鉴定

J03菌株于 LB 培养平板上培养24 h 后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生物技术有限公司）提取基因组DNA。以细菌16S rRNA基因通用引物（F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' / R:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'） 进 行PCR 扩增，引物由生工生物有限公司合成。PCR反应体系（25 μL）为：Taq 酶 0.3 μL，10×Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物各 1 μL，模板 1 μL，ddH2O 17.2μL。PCR 反应条件为：95 ℃ 5 min，95℃ 45 s，56℃ 40 s，72 ℃ 90 s，28 个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物交由上海生物工程有限公司测序。测序结果于NCBI上进行Blastn比对，选取GenBank中同源性较高的序列，采用MEGA6.0软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树，确定分离菌株的分类地位。

1.2.4 菌株J03对二氯喹啉酸降解效率的测定

参考胡杨等[21]的方法，设置HPLC检测条件：流动相为甲醇＋0.5%乙酸（体积比为65∶35）；流速为1.0 mL/min；柱温为40℃；检测波长为240 nm；进样体积为10 µL；色谱分离柱为C18柱（4.6 nm×250 nm，5 µm，安捷伦）。

以不加菌液只含相同浓度二氯喹啉酸的无机盐培养基和不加二氯喹啉酸只加J03菌株的无机盐培养基为对照；利用高效液相色谱法测定添加J03菌株且含5 µg/mL 二氯喹啉酸处理和对照培养液中的二氯喹啉酸，标准物质为纯度为99.9%的二氯喹啉酸，取样时间分别为第7 d 和第21 d，样品体积为1 mL；将样品在8000 r/min 条件下离心10 min，上清液经0.22 µm滤膜过滤后用于HPLC分析，通过下列公式求得二氯喹啉酸降解率，每个处理3次重复。

1.2.5 J03菌株对二氯喹啉酸胁迫下烤烟叶片生长的修复

将J03菌株接种于LB液体培养基，30℃，150 r/min培养24 h 获得菌悬液，再用LB液体培养基将菌悬液浓度调整为108cfu/mL，现配现用。

配制浓度为0.1 mg/L的二氯喹啉酸母液，备用。取未施用过二氯喹啉酸的山土，装入花盆，每盆2.5 kg，土壤设4个处理：T1：喷施250 mL 二氯喹啉酸母液并混合均匀使其终浓度为0.01 mg/kg 土壤；T2：喷施250 mL 二氯喹啉酸母液并混合均匀使其终浓度为0.01 mg/kg 土壤，再加入200 mL 浓度为108cfu/mL 的菌悬液混匀；T3：只加入200 mL 108cfu/mL 的菌悬液混匀；T4：只加入200 mL LB培养基；3次重复，以土壤不做任何处理为对照，所有处理和对照均浇水保持土壤湿润。

选取生长一致的烟苗，于土壤处理后2 d移栽入上述花盆中。30 d后测量有效叶第5、6、7叶的长、宽，按照以下公式计算叶面积及修复效果：叶面积（S）=长×宽×0.6345；修复效果=（ST2-ST1） /SCK[22]。

1.2.6 菌株J03对烤烟二氯喹啉酸药害的防治效果

二氯喹啉酸药害修复田间小区试验设在福建省长汀县濯田镇。起垄后按照900 g / hm2的用量在畦面上喷施50%二氯喹啉酸可湿性粉剂后盖膜。15 d 后打穴，将浓度为108cfu/mL 的J03菌液200 mL 施于移栽穴中，2 d 后移栽，移栽后30 d 调查药害发生情况，3次重复，每小区30株，以喷施50%二氯喹啉酸而不施用J03菌液为对照。

按《烟草除草剂药害分级及调查方法》（YC/T 526-2015）[7]进行药害严重度分级，计算药害指数（I）。

按以下公式计算田间药害防治效果：防治效果=（I对照- I处理） / I对照

1.3 数据分析

利用SPSSv18.0 数据处理软件分析各处理之间的差异显著性。

2 试验结果

2.1 二氯喹啉酸降解菌的分离与富集

经连续继代培养10次后，经平板划线分离，获得单菌落菌株，菌落呈黄色、圆形、隆起、不透明、边缘整齐（图1），编号为J03。

2.2 菌株J03的Biolog代谢芯片鉴定

菌株J03经Biolog Microstation TM全自动细菌鉴定程序分析，系统将其匹配为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），PROB=0.996，SIM=0.731，可代谢利用糊精、D-纤维二糖等27种碳源（图2）。

图1 菌株J03在LB平板上培养24 h 的菌落形态Fig.1 Colony morphology of strain J03 cultured on LB plate for 24 hours

2.3 菌株J03的系统发育鉴定

NCBI核苷酸序列比对结果显示：菌株J03的16S rDNA 的核苷酸序列（GenBank MK333286）与嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）UPMPR7 菌株(GenBank Accession No.MF197702.1)的相似度为99.9%。进化树显示菌株J03与嗜麦芽寡养单胞菌亲缘关系最为紧密，聚类于同一进化分支。基于序列比对与系统进化分析认定菌株J03为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。

图2 J03菌株Biolog GenⅢ微孔板测试结果Fig.2 Biolog GenⅢ multi-trait test results of strain J03

图3 菌株J03的系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree of strain J03

2.4 菌株J03对二氯喹啉酸的降解效率

测定结果如图4所示，培养7 d 后，菌株J03对二氯喹啉酸的降解率为10.30%；培养21 d 后，对二氯喹啉酸的降解率为33.50%。

图4 菌株J03在液体无机盐培养基中对二氯喹啉酸的降解率Fig.4 Degradation rate of quinclorac by strain J03 in liquid mineral salt medium

2.5 菌株J03对二氯喹啉酸胁迫下烤烟叶片生长的修复

各处理所测量叶片的叶面积和（表1）表现为T3＞T2＞CK＞T1＞T4。菌液处理和二氯喹啉酸+菌液处理，叶面积均显著高于对照，而二氯喹啉酸处理和培养基处理，叶面积均显著低于对照，表明菌株J03可以修复二氯喹啉酸胁迫下烤烟叶片的生长，修复效果为33.46%。

2.6 菌株J03对二氯喹啉酸药害的防治效果

田间小区试验结果表明，移栽前穴施J03菌液处理组烤烟的药害指数为57.84，对照组药害指数则高达91.70，J03菌液处理对烤烟二氯喹啉酸田间药害的防治效果为36.92%（图5）

图5 菌株J03对烤烟二氯喹啉酸药害的防治效果（a：田间长势；b：药害指数）Fig.5 Control efficacy of strain J03 on quinclorac injury in tobacco(a: tobacco growth in the field; b: Phytotoxicity index)

表1 菌株J03对二氯喹啉酸胁迫下烤烟叶面积的影响Tab.1 Effect of strain J03 on the area of tobacco leaves under the stress of quinclorac

3 讨论

二氯喹啉酸的半衰期长，在偏酸、质地紧密的土壤中降解速率慢的特点，与烟稻轮作制的烟区发生药害的现象总体趋势上是吻合的。

本研究筛选获得的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)为革兰氏阴性菌，属严格需氧杆菌，在系统分类学上属于细菌界、变形菌门、变形菌纲、黄单胞菌目、黄单胞菌科、嗜麦芽寡养单胞菌属，在自然界中分布广泛。尽管已有研究表明嗜麦芽寡养单胞菌可降解二氯喹啉酸[23]，但其对二氯喹啉酸的降解效率和对二氯喹啉酸胁迫下烤烟生长的作用尚未见报道。此外，有研究表明同属不同种的寡养单胞菌对除草剂磺酰磺隆具有较好的降解能力[24]。

本研究表明寡养单胞菌J03菌株对二氯喹啉酸在无机盐培养基中的降解效率在21 d 后为33.5%，与前人报道的其他降解菌对二氯喹啉酸的降解效率相差较大。例如Li等[16]报道1株分支杆菌在7 d 时间内对二氯喹啉酸的降解率达到97.38%； Lang等[17]报道1株链霉菌在18 d 时间内对二氯喹啉酸的降解率达到97.2%。造成该种差异与多种因素有关，如试验过程中的接菌量、培养条件及菌株本身降解能力差异等。然而，盆栽试验结果表明该菌株能有效缓解二氯喹啉酸对烟株生长的影响，添加菌株和二氯喹啉酸的烟株生长健康无受害状，而仅添加药液的处理，烟草受害明显，仅添加LB培养的处理，烟株受害可能与培养基中的高盐含量有关；田间小区试验进一步证实施用J03菌株可有效降低田间烟株的二氯喹啉酸药害程度，防治效果为36.92%。为此，该菌在大田生产上具有修复烤烟田间二氯喹啉酸药害的应用潜力。

烟草生长受二氯喹啉酸危害可能与活性氧中毒有关。已有研究表明二氯喹啉酸可引起稗草活性氧中毒现象[25]，即二氯喹啉酸胁迫导致植物细胞产生活性氧从而对植物生长产生危害。有研究表明在二氯喹啉酸胁迫下，嗜麦芽寡养单胞菌可超表达超氧化物歧化酶和过氧化氢酶[23]，该酶是生物有机体活性氧清除系统的重要组成部分，可使细胞免受或降低因活性氧造成的伤害。同时，已有研究表明不同微生物对于降低活性氧危害的机制有所不同[26]。本研究结果证实从福建植烟土壤中富集分离获得的嗜麦芽寡养单胞菌可修复二氯喹啉酸对烟草的危害，一方面可能是由于该菌株的降解作用使土壤中的二氯喹啉酸浓度降低，另一方面也可能是由于该菌株在二氯喹啉酸胁迫下产生超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，缓解了活性氧对烟株细胞的危害。

4 结论

从福建植烟土壤中分离获得的二氯喹啉酸降解菌为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），在室内条件下培养21 d后，对二氯喹啉酸的降解效率为33.5%；盆栽条件下能有效修复二氯喹啉酸胁迫下烤烟叶片的生长，修复效果为33.46%；小区试验中，噬麦芽寡养单胞菌J03对烤烟二氯喹啉酸药害的防治效果为36.92%。