微池顶空萃取GC-MS法分析香茅草挥发性风味成分

施志凡，尹金芳，左怡丹，熊华斌，杨志，高云涛*,戴建辉*

(云南民族大学化学与环境学院，云南省生物高分子功能材料工程技术研究中心，昆明 650500)

香茅草[Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf]别名柠檬草，禾本科草本植物，在我国主要分布于华南、西南等地[1]。因其具有独特的芳香风味，具有疏风通络、和胃通气、安神醒脑等药理功效，广泛应用于食品调料中[2]。香茅草含有多种挥发性风味成分，且含量较高[3]，因此对其挥发性成分的研究受到关注[4]。李国明等[5]采用水蒸气蒸馏法分离、GC-MS分析，从瑞丽柠檬香茅草中鉴定出桂花醛、柠檬醛、香茅醇等43种挥发性成分；喻世涛等[6]同样采用水蒸气蒸馏法获得不同香茅草中的挥发性成分，经GC-MS鉴定出柠檬烯、香茅醛、香茅醇、香叶酯等34种挥发性成分。

顶空微萃取技术包括顶空固相微萃取、单滴顶空微萃取，因其具有自动便捷、快速高效、功能多样等优点[7-9]，在挥发性风味物质分析中获得广泛应用[10-12]。固相微萃取操作方便、无需溶剂、灵敏度高，但其成本较高，多次使用后可能出现萃取头交叉污染等问题[13-15]；单滴顶空微萃取虽成本低、装置简单、有机溶剂用量少，但亦存在萃取剂悬挂稳定性差和有机溶剂挥发损失过快的问题，导致无法使用乙酸乙酯、石油醚等挥发性有机溶剂。近年来，离子液体具有较低的蒸汽压、挥发损失小[16-18]，在单滴顶空微萃取中的应用受到关注，但因其密度大、易脱落，且不能等其他有机溶剂反萃取后才能进行分析检测将其应用于单滴顶空微萃取[19,20]。

本文制作了一种新型的微池顶空微萃取装置，使用挥发性乙酸乙酯作为萃取剂，实现了香茅草挥发性成分的顶空微萃取，结合GC-MS对香茅草主要风味成分进行了分析[21]。本文提及的装置克服了溶剂悬挂稳定性差的问题，萃取剂用量大幅增加，更重要的是，该装置可使用萃取性能优良的乙酸乙酯等挥发性溶剂为顶空萃取剂，且简单易操作、快速分析、萃取效率高，作为挥发性风味物质的快速分析方法，具有良好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

香茅草样品采于云南省德宏州芒市中山乡，经教育部-国家民委民族药资源化学重点实验室杨青松副教授鉴定为禾木科香茅属柠檬草[Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf]，采集的香茅草样品将茎叶部分清洗，风干，切成小段放入粉碎机中研磨至60目以下，置于密封袋内冷藏保存。

1.1.2 试剂

正己烷(色谱纯)、乙酸乙酯(色谱纯)、石油醚(色谱纯)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体[C4MIM][BF4](上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 仪器与设备

1.2.1 仪器

KO733B730000080气质联用仪 美国赛默飞世尔科技公司；微量进样器(50.0，10.0 μL) 上海安亭科学仪器厂；20 mL钳口顶空瓶。

1.2.2 微池顶空萃取装置

本文采用微池萃取装置代替进样针单滴微萃取装置，见图1。

图1 微池顶空萃取装置结构(a)及微池剖面(b)

该装置包括吸盘、挂柱、微池三部分，均为四氟乙烯材料，微池内最多可容纳200.0 μL萃取剂，挂柱一端与微池通过卡口连接，另一端与吸盘连接，吸盘与顶空瓶垫片吸合，从而使微池探入顶空瓶内。使用时将样品置于顶空瓶底部，将带有微池的顶空瓶盖与顶空瓶口密闭钳合，用微量进样器吸取适量萃取剂，针头刺破顶空瓶垫并将萃取剂注入微池中，在一定温度下顶空萃取一定时间，用进样器吸出微池中的剩余萃取剂进行后续分析。

1.3 方法

1.3.1 单滴顶空微萃取

用10.0 μL微量进样器移取一定体积的萃取剂，进样器针头刺入顶空瓶内，针尖到达顶空瓶1/3位置处，推送萃取液形成液珠悬挂于微量进样器针尖，在一定温度下，悬挂一定时间，将萃取剂吸回微量进样器内读取其剩余体积，进行后续分析，离子液体萃取剂用正己烷反萃取后[22]，进行后续分析。

1.3.2 微池顶空萃取

称取1.5 g香茅草样品加入顶空瓶中，根据1.2.2中图1的微池顶空萃取装置，用微量进样器移取一定体积萃取剂，进样器针头刺入顶空瓶内，将萃取剂注入微池内，在一定温度下萃取一定时间，用进样器吸出微池中的剩余萃取剂，读取其剩余体积，进行后续分析。

1.3.3 GC-MS分析

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：DB-WAX(30 m×0.25 m×0.25 μm)毛细管色谱柱；进样口温度220 ℃，检测器温度220 ℃；柱初温45 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升到90 ℃，保持2 min；再以6 ℃/min升到200 ℃，保持5 min；高纯氦气(纯度>99.999%)；载气流速1.0 mL/min；分流比10∶1；进样量1.0 μL。

1.3.3.2 质谱条件

电子轰击离子源(EI)；传输线温度280 ℃；离子源温度260 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围30～500 m/z。

2 结果与讨论

2.1 微池顶空萃取条件下4种萃取剂的稳定性

图2 不同萃取时间下萃取剂的剩余量

本文选择正己烷、乙酸乙酯、石油醚、离子液体([C4MIM][BF4])4种顶空萃取剂测试其在进样针针尖上的悬挂量，最大悬挂量为：离子液体(4.9 μL)>石油醚(4.7 μL)>正己烷(4.4 μL)>乙酸乙酯(4.0 μL)，均不超过5.0 μL，这说明上述溶剂由于重力、表面张力、沸点、蒸汽压、粘度等性质影响，其在进样针针尖的悬挂稳定性通常较差，可悬挂溶剂量较少。进一步考察正己烷、乙酸乙酯、石油醚、[C4MIM][BF4]离子液体4种萃取剂在单滴顶空微萃取过程中的挥发稳定性，由图2a可知，室温(20 ℃)条件下，当萃取剂初始体积为4.0 μL时，4种萃取剂的回收量随萃取时间的变化，除[C4MIM][BF4]离子液体具有较好的挥发稳定性外，石油醚、乙酸乙酯和正已烷的回收量迅速减小，4 min之内，几乎挥发殆尽，这表明由于进样针针尖所能悬挂的萃取剂量很小，除低挥发的离子液体等溶剂之外，正己烷、乙酸乙酯、石油醚等萃取性能优良的有机溶剂并不适用于单滴顶空微萃取过程。

针对单滴顶空微萃取装置存在的萃取剂稳定性问题，本文设计的微池顶空萃取装置(见图1)将萃取剂置于微池中而不是悬挂于进样针针尖，相对单滴顶空微萃取法，微池顶空萃取萃取剂初始用量可达到200 μL，增加数十倍，由图2b可知，当萃取剂初始用量50.0 μL时，室温(20 ℃)条件下顶空萃取3种挥发性萃取剂的回收量依次为：石油醚(6.0 μL)<正己烷(12.0 μL)<乙酸乙酯(27.0 μL)，明显优于单滴顶空微萃取装置。

在萃取剂初始用量50.0 μL和萃取时间20 min条件下，微池顶空萃取温度对萃取剂回收量的影响见图3。

图3 微池顶空萃取温度对萃取剂回收量的影响

注：萃取时间为20 min；萃取剂初始体积为50.0 μL。

随着萃取温度增加，除[C4MIM][BF4]离子液体回收量几乎不变之外，其他3种挥发溶剂回收量迅速减小，当萃取温度达50 ℃时，石油醚、正己烷和乙酸乙酯的剩余量分别为5，16，23 μL，当萃取温度达60 ℃时，经过20 min的较长时间萃取，石油醚几乎完全挥发，而正己烷和乙酸乙酯仍然分别有10.0 μL和3.0 μL的剩余量，能较好地满足气相色谱法或GC-MS法对进样样品用量的要求。

2.2 4种萃取剂的微池顶空萃取性能

萃取剂初始用量为50 μL，萃取时间为20 min和萃取温度为45 ℃条件下，研究了正己烷、乙酸乙酯、石油醚和[C4MIM][BF4]离子液体4种萃取剂对香茅草挥发性风味的物质萃取性能，4种萃取剂微池顶空萃取物的GC-MS测定结果见图4。

图4 香茅草正己烷(a)、乙酸乙酯(b)、石油醚(c)和[C4MIM][BF4]离子液体(d)微池顶空萃取物的GC图

由图4可知，正己烷(22个峰)、乙酸乙酯(25个峰)、石油醚(21个峰)均比[C4MIM][BF4]离子液体(16个峰)获得更多的色谱峰，具有更好的萃取效果。

4种萃取剂中柠檬烯、香茅醛、香茅醇、香叶醇、乙酸香茅酯、乙酸香叶酯和榄香烯7种香茅草特征风味物质测定色谱峰面积值见图5。

图5 室温(20℃)下不同萃取剂中7种挥发性风味物质的色谱峰面积

注：温度为20 ℃，萃取时间为10 min，萃取剂体积为50.0 μL。

由图5可知，乙酸乙酯对7种特征风味物质具有较高的色谱峰面积，其次是石油醚和正己烷，[C4MIM][BF4]离子液体萃取性能最差，甚至不能检测出香茅醇和香叶醇两种重要风味物质，进一步说明乙酸乙酯对香茅草特征风味物质具有较好的萃取性能，因此，本文选择乙酸乙酯作为顶空萃取剂进行后续实验。

由上述实验结果可知，本文基于微池顶空萃取装置建立的微池顶空萃取法，萃取剂初始用量可达50.0 μL甚至更高，较单滴顶空微萃取法萃取剂用量5 μL增加10倍以上，即使挥发性较强的萃取剂，在经过较长时间顶空萃取后，仍然有足够萃取剂剩余量供后续的GC或GC-MS等分析，相对于离子液体单滴顶空微萃取方法，微池顶空萃取法可选择性能更为优良的挥发性顶空萃取剂，获得更好的萃取效果，该且方法检出灵敏度较单滴顶空微萃取方法有较明显提高。

2.3 微池顶空条件优化

2.3.1 萃取温度的影响

在萃取剂用量50.0 μL，萃取20.0 min条件下，研究萃取温度对乙酸乙酯顶空萃取7种典型挥发性风味物质效率的影响，结果见图6。

随着温度升高，挥发性风味物质色谱峰面积随之增加，萃取温度达到45 ℃时色谱峰面积达到最大，萃取温度超过45 ℃后，色谱峰面积随着温度升高反而下降。可能是目标物质在萃取剂和气相中的分配服从亨利定律，温度增加，目标物质的分压也随之增加，导致其在溶剂中的溶解能力下降。其次，温度过高也易导致顶空瓶内出现挂水珠的情况，部分目标物进入水珠中，从而影响萃取平衡。因此，本文确定其最佳萃取温度为45 ℃。

图6 萃取温度对萃取效率的影响

注：萃取剂体积为50 μL，萃取时间为20 min。

2.3.2 萃取时间和萃取剂用量的影响

进一步研究萃取时间对萃取性能的影响，见图7。

图7 萃取时间对萃取效率影响

随着萃取时间增加，各物质色谱峰面积也随之增加，萃取时间达到15.0 min时各萃取峰面积接近最大，至20.0 min时趋于平缓，20.0 min后几乎不变，本文确定的最佳萃取时间为20 min。

在萃取剂体积分别为20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，70.0 μL时，研究萃取剂体积对萃取性能的影响，见图8。

图8 萃取剂体积对萃取效率的影响

各目标物质的色谱峰面积随着萃取剂体积的增加而增加，当用量达到40.0 μL时色谱峰面积达最大，但萃取剂用量超过50.0 μL，色谱峰面积反而减少，可能是萃取剂用量过大的稀释作用所致，且萃取剂体积过多达到反应平衡所需时间也随之增长，因此，本文确定的萃取剂体积为40.0 μL。

2.4 香茅草挥发性风味物质微池顶空萃取GC-MS分析结果

本文采用微池顶空萃取法用乙酸乙酯作为萃取剂，初始体积为40.0 μL，样品用量为1 g，在温度为45 ℃下平衡15 min，通过GC-MS分析香茅草挥发性风味成分的种类及相对含量，并与[C4MIM][BF4]离子液体初始体积4.0 μL，单滴顶空微萃取进行比较，其结果见表1。

表1 不同萃取法萃取香茅草中挥发性成分及峰面积

由表1可知，乙酸乙酯微池顶空萃取共鉴定出25种香茅草挥发性风味成分，而单滴顶空微萃取仅萃取出13种，这表明本文提出的乙酸乙酯微池顶空萃取较单滴顶空微萃取具有更高的萃取效率。本研究获得的香茅草主要挥发性成分相对含量最高的成分是香茅醛(20.35%)，其次依次为香茅醇(18.59%)、柠檬烯(16.60%)、香叶醇(14.13%)、榄香醇(7.34%)、α-榄香烯(4.33%)、乙酸香叶酯(2.78%)、乙酸香茅酯(2.73%)、桉叶油醇(1.99%)、γ-荜澄茄烯(1.43%)、杜松醇(1.38%)、异胡薄荷醇(1.30%)、石竹烯(1.25%)、癸醛(1.00%)、2,6-二甲基-5-庚烯醛(0.99%)、芳樟醇(0.78%)、D-大根香叶烯(0.67%)、肉豆蔻酸(0.49%)、金合欢醇(0.51%)、甲基庚烯酮(0.34%)、α-依兰油烯(0.29%)、甲酸香叶酯(0.23%)、4-甲基-1-(1-甲基乙基)-双环[3,1,0]己二烯(0.23%)、角鲨烯(0.16%)、癸酸(0.14%)等。由结果可知，香茅草中的成分大多为醇类、酯类和烯类物质。香茅醛具有香茅、柠檬香气；香叶醇具有温和的玫瑰花香味；榄香醇带有愉悦的花香，略带辛辣的茴香气味；香茅醇具有甜玫瑰香。这些物质构成了香茅草的清香风味。经与已有文献对比，本法检出香茅草中挥发性风味成分种类与CO2超临界萃取法、水蒸气蒸馏法、固相萃取法接近，再次证明了本法的可行性价值。此外，本法具有操作简单、设备成本低廉、萃取效率高、选择性强等优点。

3 结论

本文设计并制作了一种新型微池顶空萃取装置，可明显增加顶空萃取剂用量，有效解决了挥发性有机萃取剂在顶空过程中挥发稳定性差的问题，将挥发性有机溶剂乙酸乙酯用于香茅草挥发性风味物质的顶空萃取，建立了香茅草挥发性风味物质的乙酸乙酯微池顶空萃取气相色谱-质谱联用分析方法，相对于单滴顶空微萃取，可检出更多的挥发性物质，主要挥发性风味物质检出灵敏度明显增加。相对于已有的超临界CO2萃取法、顶空固相微萃取法、水蒸气蒸馏法，本文提出的微池顶空萃取法在保证萃取效率的同时，具有简单快速、分析成本低廉等明显优点，适合于对食品中挥发性风味物质进行快速、高效的分析。