超声预处理小麦蛋白与壳聚糖复合物胶体稳定性研究

李素云，刘兴丽，张艳艳，张华，李星科，吴燕青

(郑州轻工业大学 食品与生物工程学院,郑州 450002)

1 概述

小麦蛋白又称面筋蛋白，是小麦淀粉加工的副产物，由于其具有较强的粘弹性、延伸性、薄膜成型性、吸脂乳化性等多种独特物理性质，因此在食品工业中具有重要应用[1]。但是小麦蛋白分子遇水极易交联形成粘弹性强的网络状结构，分散性差，不溶于水，这些特性使得小麦蛋白的应用具有一定的局限性。因此，许多研究利用物理、化学和生物等技术改变蛋白质的空间结构和分子排布，进而改善蛋白质的功能特性[2,3]。

本文拟通过超声处理小麦蛋白过程中产生的动态剪切、空化等作用改变其空间结构，促进蛋白质与多糖的相互作用，协同对蛋白质的结构进行修饰，从而改善蛋白的功能、界面性质和乳化性质。通过超声协同壳聚糖改善后的小麦蛋白有许多用途，比如用于保鲜的可食用膜以及微胶囊包埋营养物质和调味料等[4，5]。

本文的研究思路是利用浊度法、扫描电镜分析法、紫外-可见吸收光谱法和荧光光谱法研究超声处理作用调控小麦蛋白与壳聚糖所形成的复合物结构，解析不同pH值下小麦蛋白-壳聚糖复合物在加热、盐离子、不同复合比等条件下的状态变化和作用机理，为研究超声作用下的蛋白和阳离子多糖的相互作用提供理论基础。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料与试剂

小麦蛋白(蛋白质含量82%)：徐州澳凯小麦淀粉有限公司；壳聚糖(食品级)：平均分子量在150～500 kDa，脱乙酰度大于90%，水分8.0%，灰分0.7%：郑州优然食品配料有限公司；主要试剂冰乙酸、氢氧化钠等：均为化学试剂，天津市大茂化学试剂厂。

2.2 实验仪器与设备

VCX750超声波细胞破碎仪 上海苑胜仪器设备有限公司；UV-3200S紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；F-7000荧光分光光度计 日本日立公司；SEM、JSM-6490LV扫描电镜 日本JEOL公司。

2.3 实验方法

2.3.1 小麦蛋白的超声处理

称取一定质量的小麦蛋白分散于去离子水中,配制成蛋白浓度为5 mg/mL，然后进行超声预处理。超声参数为：超声功率169 W/cm2，超声10 min，间歇比为4/2 s，得到超声预处理的小麦蛋白溶液。

2.3.2 小麦蛋白-壳聚糖溶液的制备

制备浓度为10 mg/mL的壳聚糖溶液：称取一定质量的壳聚糖溶解在浓度为0.1 mol/L、pH为3.0的乙酸缓冲液中，在室温下(20 ℃)搅拌3 h，放入冰箱中水化静置12 h。

小麦蛋白-壳聚糖溶液的制备：将蛋白与壳聚糖按照一定质量比、不同比例混合后，通过补足乙酸缓冲液，调节 pH 的方式制得。本文讨论的复合溶液是在不同pH(3.0～8.0)、不同蛋白质-壳聚糖复合比(简称不同复合比)、不同离子强度(氯化钠)和加热条件下(60 ℃)形成的。通过观察其浊度来表征复合溶液的稳定性。

2.3.3 复合物浊度的测定

利用分光光度计来检测小麦蛋白-壳聚糖复合溶液的浊度。复合溶液静置稳定30 min后将待测样品倒入比色皿中，在600 nm处测其吸光值，每组样品平行3次，取平均值。

2.3.4 复合物粉末的制备

在pH为6的条件下将壳聚糖、小麦蛋白、小麦蛋白-壳聚糖(WP-CS)、超声处理的小麦蛋白-壳聚糖(超声WP-CS)溶液进行真空冷冻干燥处理，得到固体粉末。

2.3.5 复合物的荧光光谱分析

将依据2.3.4制得的冻干粉末用0.1 mol pH为7的磷酸缓冲液溶解稀释，使蛋白质含量为0.25 mg/mL，离心取上清液。采用F-7000型荧光光谱仪进行荧光测定，实验选择260 nm下激发，扫描范围为270～450 nm，扫描速度为240 nm/min,激发和发射狭缝宽为5 nm，所用样品池长为1.0 cm。

2.3.6 复合物溶液紫外-可见吸收光谱分析

将2.3.5制得的上清液用0.1 mol pH为7的磷酸盐缓冲液适度稀释，使得蛋白质含量为0.06 mg/mL，用于紫外-可见光谱分析，光波波长设定范围为220～400 nm，分辨率为0.5 nm，测定时以磷酸盐缓冲液作为空白。

2.3.7 复合物扫描电镜分析

使用SEM测复合物的微观形态。首先取少量均匀的粉末状样品用双面胶固定，将固定后的样品放入离子溅射装置中涂金作为导电膜，时间设定为120～130 s。

3 结果分析

3.1 不同pH值对小麦蛋白-壳聚糖复合体系溶解性的影响

体系的pH值对大生物聚合物电荷密度影响很大，从而影响聚合强度。不同pH 值对壳聚糖、小麦蛋白和WP-CS(2∶1)溶解性的影响见图1。

图1 不同pH 值对壳聚糖、小麦蛋白和小麦蛋白-壳聚糖(2∶1)溶解性的影响

由图1可知，溶液体系有澄清、半透明、浑浊，部分相分离和完全相分离状态。CS在pH 7～8时状态为浑浊，其他状态都是澄清的，这是因为随着 pH 增高并达到 CS 的 pKa 值以后，CS所带的正电荷逐步降低，发生聚集并产生浑浊状态。小麦蛋白在 pH 7～8时发生部分相分离，这是由小麦蛋白的等电点决定的。当在WP溶液中加入CS时，相分离的pH 范围从pH 5～7上升到 pH 6～8。这是由于当pH值大于等电点时小麦蛋白携带负电荷，随着带有阳离子性质的壳聚糖的增加，混合物出现了不同程度的凝聚现象。

3.2 超声预处理小麦蛋白对复合物在不同复合比条件下胶体稳定性的影响

图2 超声预处理小麦蛋白-壳聚糖复合物在不同复合比条件下的胶体稳定性

研究证实，体系中蛋白与多糖的比例会影响其复合物的稳定性[6]。由图2(a)可知，未经过超声处理的复合物，复合体系的浊度随着pH值的增加而变大，当pH达到6时，浊度最大；但是随着复合比中蛋白含量的增加，浊度出现先增大后减少的趋势，并在复合比为2∶1时达到最高。这是因为蛋白过高会导致过多的蛋白聚集在复合物表面，产生排斥力，因而浊度下降，此研究结果和Dickinson E等[7]研究的β-乳球蛋白与黄原胶的复合体系结论相似。

由图2(b)可知，经过超声处理的WP-CS复合体系，其浊度的变化趋势和未超声的复合物体系相同，但是浊度的最大值与未超声处理相比显著降低。可能是因为超声作用使蛋白质内部的氨基酸残基暴露在外，增加了蛋白质的表面电荷，加大了与壳聚糖的结合，进而改变复合物的溶解性。Yang等[8]研究表明，超声处理能够明显提高蛋白质的溶解性、蛋白质悬浮液的乳化、蛋白质亚基的聚合。综上所述，选择复合比为2∶1进行其他影响因素研究。

3.3 超声预处理小麦蛋白-壳聚糖复合物在加热条件下对胶体稳定性的影响

温度是影响蛋白质-壳聚糖复合物胶体稳定性的另一个重要因素，WP-CS复合物通过加热处理会在短时间内改变体系间相互作用力的平衡，从而改变复合体的稳定性[9]。

图3 超声预处理小麦蛋白-壳聚糖复合物在加热条件下对胶体稳定性的影响

由图3可知，仅对复合物进行加热处理可以引起体系浊度的降低，这是由于热处理在短时间内会引起蛋白质的变性，使处在蛋白质分子内部的部分疏水基团裸露在外部，导致蛋白质与壳聚糖之间的疏水作用增强；当超声和加热协同作用时，和未超声相比，浊度在低pH和高pH没有显著性差异，但是在pH 6～8之间，加热联合超声使复合体系的浊度急剧下降，推测原因可能是超声的空穴效应加大了与液体的接触面积并且形成的大量气泡使蛋白质周围的压强增大[10]，促使亲水氨基酸暴露出来，聚合体更加稳定，从而使复合体系的浊度降低。

3.4 超声预处理小麦蛋白对复合物在盐离子条件下胶体稳定性的影响

盐离子的存在会屏蔽壳聚糖链上的正电荷，改变蛋白质氨基酸侧链上的电荷分布，使蛋白质与壳聚糖的相互作用减小，造成结合能力降低。

图4 超声预处理小麦蛋白-壳聚糖复合物在盐离子条件下对胶体稳定性的影响

由图4可知，盐离子的存在导致复合体系浊度降低，这可能是小麦蛋白中的球蛋白溶于盐溶液的原因。但是超声对复合体系的浊度影响是在低pH时升高的，在高pH时浊度降低，原因可能是低pH时超声导致球蛋白溶解性降低，在较高pH 时使部分蛋白聚集成大分子，从而使浊度降低。

3.5 超声预处理小麦蛋白对复合物凝胶体系的荧光强度影响

内源性荧光对蛋白质的色氨酸残基的微环境变化和空间结构变化具有较高的灵敏度和选择性等优点[11]，成为研究WP-CS复合体系相互作用最有效的方法。

图5 小麦蛋白-壳聚糖复合物溶液的荧光光谱

由图5可知，壳聚糖的加入以及超声处理都对小麦蛋白产生一定的影响，复合物的荧光强度明显大于纯蛋白，且峰值发生轻微的蓝移。推测可能是由于壳聚糖的加入使小麦蛋白色氨酸残基的微环境发生轻微的变化。超声处理后的WP-CS复合物较未超声处理的复合物荧光强度降低，说明超声处理改变了蛋白质的三级空间结构，使酪氨酸和色氨酸残基暴露，进而影响了与壳聚糖之间的相互作用，使荧光强度较未超声处理的降低。

3.6 超声预处理小麦蛋白对复合物凝胶体系的紫外-可见吸收光谱影响

紫外-可见光谱法是研究蛋白质的三级构象是否发生改变的一种最常用的实验手段，通过对其进行紫外分析来获得更多蛋白质结构变化的信息[12]。

图6 小麦蛋白-壳聚糖复合体系的紫外可见吸收光谱

由图6可知，随着壳聚糖的加入，WP-CS复合体系的最大吸收峰增加并发生了轻微的红移，可能是由于蛋白质与壳聚糖之间的相互作用改变了蛋白质所处的微环境。同时，超声处理WP-CS复合体系，使最大吸收峰降低并发生了红移，这说明蛋白质的三级构象发生改变，这是由于超声处理使氨基酸残基向更加疏水的环境中移动。

3.7 超声预处理小麦蛋白对复合物凝胶体系的微观结构影响

图7 小麦蛋白-壳聚糖复合体系的电镜分析

通过扫描电镜观察复合物的微观结构可以推测出蛋白分子的功能性质如何改变。由图7(a)可知，壳聚糖呈扁平状分布，体积较大；图7(b)中蛋白质呈无规则颗粒、球状，体积较小；而图7(c)呈现出蛋白附着在扁平块状上，这是因为蛋白质溶液在高于其等电点时开始带负电荷，与壳聚糖带正电荷相互静电作用，出现了凝聚现象。图7(d)中复合物经过超声处理，与图7(c)相比，颗粒分布均匀，蛋白附着在壳聚糖表面上的颗粒增加。这是因为经过超声处理，使更多的疏水基团暴露于蛋白表面，蛋白质分子打开，增大了与壳聚糖的溶解性，使复合物形成一种致密的网络结构。

4 结论

本研究选择超声和未超声的小麦蛋白与壳聚糖形成复合水溶液体系，并通过调控 pH 值、复合比、温度和离子强度来对比研究WP-CS和UWP-CS所形成的复合体系的相行为，得到如下结论：

WP-CS和UWP-CS形成稳定胶体的最佳条件均是WP∶CS为2∶1，pH为6，温度为20 ℃，无盐离子情况下，在低超声功率下，UWP-CS的稳定性强于WP-CS。在加热和添加盐离子的条件下，UWP-CS复合体系的浊度要低于WP-CS，说明超声处理使蛋白质结构部分打开，柔性增强，加大了与壳聚糖结合的能力；通过紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和扫描电镜对WP-CS和UWP-CS复合物结构性质分析可知，与未超声的复合物相比，超声处理可使蛋白质的三级构象和所处的微环境改变，凝聚物减少，可溶性复合物增加，与壳聚糖的相互作用加强，从而影响复合体系的稳定性及其他相关性质。