DDR2血管内皮细胞条件性基因敲除小鼠的复制、鉴定及表型分析*

王婷婷，卜歆，李金奎，王娜，邱意开，岳振生，苏金，张淑雅

[1.宁夏医科大学基础医学院 生育力保持教育部重点实验室（生物化学与分子生物学系），宁夏 银川 750004；2.空军军医大学基础医学院 生物化学与分子生物教研室，陕西 西安 710032；3.宁夏医科大学总医院 急诊科，宁夏 银川 750004]

胶原的盘状结构域受 体2（discoidin domain receptor 2, DDR2）是一种位于细胞膜的酪氨酸蛋白激酶受体，由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成，胞外盘状结构域被胶原识别并激活，进而介导盘状结构域发生二聚化，触发胞内催化结构域的酪氨酸残基发生自磷酸化[1]。磷酸化的酪氨酸激酶介导细胞外基质胶原向细胞内的信号传递[2]。DDR2 高表达于激活状态的血管内皮细胞（例如，心脏瓣膜内皮细胞发生内皮间充质转化的过程[3]，肿瘤血管内皮细胞[4]）。前期研究发现，DDR2 自发全身性突变缺失小鼠肿瘤血管新生障碍，能显著抑制肿瘤的生长与转移。另有文献[5]报道，DDR2 全身性敲除促进小鼠肝纤维化的发生、发展，提示DDR2 在生理和病理性血管新生中扮演十分重要的调控作用，但对血管内皮细胞中DDR2 对血管新生的调控机制尚不清楚。为深入研究血管内皮细胞中DDR2 在血管新生中的作用及分子机制，本研究设计基于同源重组理论，利用胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES cell）（ES 细胞）打靶及显微注射技术，复制DDR2flox/flox小鼠，利用Cre/LoxP 系统复制DDR2在血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠（DDR2flox/flox，Cdh5-Cre/ERT2），可以选择性地在小鼠发育的不同时间诱导敲除血管内皮细胞中的DDR2，希望为深入研究DDR2 在生理性及病理性血管新生中的作用提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6N 小鼠购自南京大学南京生物医药研究院，Cdh5-Cre/ERT2小鼠由空军军医大学韩骅教授馈赠，所有实验小鼠均按照无特定病原级动物饲养标准饲养。

1.1.2 试剂与仪器 基因组提取试剂盒（北京天根生物有限公司），PCR 引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]，PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司），琼脂糖（上海碧云天生物技术公司），他莫昔芬（美国Sigma 公司），玉米油（美国Sigma 公司），小鼠CD146免疫磁珠（德国Miltenyi 公司，130-092-007），小号磁力柱（德国Miltenyi 公司，130-042-201），ECM 培养基（美国Scien Cell 公司，1001），DMEM（美国Hyclone 公司），IV 型胶原酶（美国Sigma 公司，C5138），100 μm 细胞筛网（美国BD 公司，352360），DDR2 抗体（美国R&D公司，MAB2538）。MACSTM 全自动组织处理器（德国Miltenyi 公司），低温高速离心机（美国Eppendorf 公司），Olympus X71 倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司），FC500 流式细胞仪（美国Beckman coulter 公司）。

1.2 方法

1.2.1 DDR2 条件性基因敲除（conditional gene knockout, CKO）策略 小鼠DDR2基因全长116.64 kb，包含17 个外显子，编码的蛋白质由854 个氨基酸组成，本策略（见图1）是在第2 个外显子的下游内含子区插入FRT-Neo-FRT-LoxP 元件，在第3 个外显子的下游的内含子区插入另外一个LoxP 位点，利用Cre 重组酶特异识别34 bp 的部分回文的LoxP 位点之间的序列，发生特异性地重组或删除。导致第3 个外显子区域的1.1 kb 序列将被Cre/LoxP 系统切除，形成移码突变而阻止蛋白质的正常翻译。

图1 DDR2 CKO 策略图

1.2.2 DDR2 CKO打靶载体的构建如图2所示，含有靶基因的细菌人工染色体（bacterial artifical chromosome, BAC）克隆购自Invitrogen，从BAC 载体扩增5'-同源臂、3'-同源臂和DDR2 基因的靶向区域，然后将这3 个片段连接到具有第1 个LoxP 和FRTNeo-FRT 的第2 个LoxP 元件的载体中。在电穿孔进入ES 细胞之前，通过PCR、酶消化和测序确认靶向载体。PGK/EM7-NeoR 盒作为ES 细胞靶向步骤的阳性选择标记，将Flox 表达菌株与floxed 小鼠杂交，或在ES 细胞阶段表达Flpe 来除去。TK 是ES 细胞靶向步骤的阴性选择标记，随机插入靶基因的细胞将死于细胞毒性。

图2 DDR2 CKO 打靶载体结构

1.2.3 ES 细胞克隆筛选及囊胚注射 将线性化的打靶载体，电转到ES 细胞进行打靶，通过长片段PCR 及脱氧核苷酸（DNA）印迹法筛选出中靶克隆，将其注射于囊胚，并移植于受体小鼠子宫，得到嵌合体小鼠（嵌合率＞50%）。

1.2.4 DDR2flox/flox小鼠的复制 根据毛色筛选嵌合率在50%及以上的雄性鼠，将其与Flper 小鼠配繁一代，去除Neo 抗性基因，排除Neo 基因对小鼠表型分析的干扰，以获得DDR2flox/flox小鼠。

1.2.5DDR2基因在血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠的获得 筛选DDR2flox/+小鼠与Cdh5-Cre/ERT2小鼠杂交，并通过子代自交获得DDR2 在血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除的纯合子小鼠DDR2i∆EC（DDR2flox/flox小鼠，Cdh5-Cre/ERT2）。

1.2.6 血管内皮细胞DDR2基因诱导敲除 在小鼠4周龄时，给予DDR2i∆EC小鼠与同窝野生对照组（wild type, WT）小鼠腹腔注射他莫昔芬，剂量为66 mg/kg，连续给药5 d。

1.2.7 肝血窦内皮细胞的分离、鉴定及DDR2 敲除效率分析 在小鼠8周龄时，用免疫磁珠法分离肝血窦内皮细胞，用流式细胞术鉴定细胞纯度，应用定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）及蛋白免疫印迹法检测血管内皮细胞DDR2 的表达。

1.2.8 肝脏病理切片HE 染色、天狼星红染色及Masson 三色染色 在小鼠3月龄时，解剖DDR2i∆EC小鼠的肝脏（选取同窝DDR2flox/flox小鼠肝脏为对照，WT），进行石蜡包埋，切片，通过HE 染色、天狼星红染色、Masson 染色及免疫组织化学检测肝脏的病理变化。

1.3 统计学方法

采 用Image Pro plus 6.0 和GraphPad Prism 6.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DDR2 CKO 打靶载体

所有质粒均经PCR 鉴定，终载体中FRT 位点至第2 个LoxP 位点间片段均存在。电转后得到药物抗性ES 细胞克隆6 个，分别经长片段PCR 及DNA blotting 鉴定，最终筛选出4 个阳性克隆。

2.2 嵌合体小鼠及DDR2 flox 小鼠

图3 DDR2 CKO 小鼠基因鉴定结果

如图3所示，显微注射后得到由基因敲除ES 细胞和供体胚胎细胞共同发育而来的嵌合小鼠。挑选嵌合率在50%及以上的成熟雄性嵌合体小鼠与Flper 小鼠配繁一代后再与野生型B6 小鼠进行交配，得到的F1 代小鼠，经PCR 鉴定基因型后获得杂合体（基因型表示为：Fln/WT）小鼠，218 与221 为杂合子小鼠，用于F0 代交配。

2.3 DDR2 血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠的繁育及鉴定结果

DDR2flox/flox小鼠与Cdh5-Cre/ERT2小鼠杂交，对后代自交后获得的小鼠进行基因型鉴定，成功获得DDR2 血管内皮细胞诱导性条件性基因敲除小鼠DDR2i∆EC（DDR2flox/flox，Cdh5-Cre/ERT2）。见图4。

2.4 血管内皮细胞DDR2 基因诱导敲除效率

用免疫磁珠法分离提取肝血窦内皮细胞，纯度达到88.4%（见图5A）。与对照组（WT）比较，DDR2在DDR2i∆EC小鼠血管内皮细胞mRNA 表达下降＞95%（WT组为（1.032±0.092），DDR2i∆EC组为（0.053± 0.025），t=6.246，P=0.002）（见图5B）。与WT 组比较，DDR2 在DDR2i∆EC小鼠血管内皮细胞中的蛋白表达下降＞95%（DDR2/β-actin 的比值在WT 组为（0.568±0.023），DDR2i∆EC组为（0.020±0.010），t=8.839，P=0.001）（见图5C、D），证明DDR2flox/flox和 Cdh5-Cre/ERT2能够高效敲除血管内皮细胞上的DDR2，DDR2i∆EC小鼠复制成功。

2.5 DDR2i ∆EC 小鼠肝脏表型分析

3月龄DDR2i∆EC小鼠肝脏呈现自发纤维化。肝脏病理切片HE 染色（见图6A）显示，DDR2i∆EC小鼠肝血窦结构排列异常，大量炎症细胞浸润，天狼星红染色 （图6B、C）阳性区域与WT 组比较，DDR2i∆EC组增加 （7.089±0.9852）倍（t=5.040，P=0.003）。Masson 染色 阳性区域显示，与WT组比较，DDR2i∆EC组增加（5.499± 0.9804）倍（t=6.480，P=0.001）（见图6D、E）。上述 结果均表明DDR2i∆EC小鼠肝脏胶原纤维沉积增多，尤其沉积在血管周围，提示血管内皮细胞中DDR2 缺失导致肝脏发生自发性纤维化病变。

图4 DDR2i ∆EC 小鼠基因型的鉴定结果

图5 肝血窦内皮细胞纯度及DDR2 表达

图6 DDR2i ∆EC 小鼠呈现自发性肝纤维化

3 讨论

作为细胞外基质胶原（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及X 型）的DDR2，属于膜表面受体型蛋白酪氨酸激酶[6]，胶原识别并激活DDR2，参与细胞增殖、迁移及细胞外基质的重塑[7]。主要在骨骼[8-9]、心脏[10]、皮肤[11]、肾[12]、肺[13-14]和卵巢[15]中高表达。近年来，DDR2 在血管新生中的作用受到重视，笔者的前期研究发现DDR2 高表达于肿瘤血管内皮细胞，肿瘤间质中DDR2 缺失能抑制肿瘤血管新生，抑制DDR2 可抑制肺纤维化过程中VEGF 的分泌而抑制病理性血管新生[16]，提示DDR2 在生理性及病理性血管新生中扮演中重要角色。但血管内皮细胞中DDR2 的作用尚未见报道，深入研究DDR2 在血管内皮细胞中的作用具有重要意义。本研究用基因打靶技术复制DDR2flox/flox小鼠，并将其与血管内皮细胞特异性Cre/ERT2小鼠（Cdh5 Cre/ERT2）进行交配，得到DDR2flox/flox和Cdh5Cre/ERT2小鼠，然后给予他莫昔芬诱导Cre 酶的活性，根据实验需要，在特定时间特异性地敲除血管内皮细胞中DDR2，分离肝血窦内皮细胞，通过qPCR 及蛋白免疫印迹法检测DDR2 敲除效率，发现血管内皮细胞中DDR2 的敲除效率高达90%以上，证明成功复制血管内皮细胞DDR2诱导性条件性基因敲除小鼠，为后续深入研究DDR2 在血管内皮细胞中的作用机制奠定基础。在表型分析中发现，血管内皮细胞DDR2条件性基因敲除后会诱发小鼠自发的肝纤维化，笔者将在后续深入研究血管内皮细胞DDR2 缺失导致肝纤维化的机制。

条件性基因敲除小鼠是将某个基因修饰定位于某些特定类型的细胞或小鼠发育的某一特定阶段的一种特殊的基因打靶技术[17]。目前条件性基因打靶主要使用来源于大肠杆菌P1 噬菌体的Cre/LoxP 系统。Cre/LoxP 系统主要由两部分组成，Cre 重组酶和Cre/LoxP 位点。Cre/LoxP 诱导系统目前是最先进的工具之一，不仅用于特定的细胞类型，而且是在特定的时间敲除目的基因[18]。本研究引用血管内皮细胞的特异性Marker 基因Cdh-5（又称为VE-Cadherin）调控Cre 的启动子[19]，通过启动子驱动Cre 重组酶的表达模式，可以在血管内皮细胞中完成特异性基因敲除[20]。在可诱导性条件性敲除的这个系统中，Cre 蛋白质被融合到一种突变的雌激素受体（ER）中，在未诱导的细胞中，Cre-ER 被隔离在细胞质中，不能发挥作用[21]。但是在给予他莫昔芬（是ER 突变体的配体）后，ER 和Cre 转移到细胞核，Cre 酶识别loxp 位点的目的基因DDR2，在loxp 位点上将目的基因DDR2切除，使DDR2 在血管内皮细胞中不能转录和翻译，从而在内皮细胞中特异性敲除DDR2，可诱导性敲除的优势在于可根据实验需要选择不同的时间点进行诱导敲除。

在小鼠的表型分析中发现，DDR2flox/flox和Cre/ERT2小鼠在给予他莫昔芬诱导后出现自发性肝纤维化，这是一个令人兴奋的现象，提示血管内皮细胞中的DDR2在防御肝纤维化过程中扮演重要角色。文献报道DDR2全身敲除小鼠慢性四氯化碳导致的肝纤维化模型中，DDR2 缺失导致肝纤维化加重[22]。要阐明血管内皮细胞中DDR2 在肝纤维化中的作用机制需要DDR2 内皮细胞条件性基因敲除小鼠，本研究复制的DDR2flox/flox和Cdh5-Cre/ERT2小鼠将为后续深入研究奠定基础，具有非常重要的意义。