肺癌食管癌缺失基因1及其甲基化在鼻内翻性乳头状瘤中的表达研究*

蒋伟蓉，唐金勇，李云秋，钟宇

（1.湖南岳阳职业技术学院，湖南 岳阳 414000；2.郴州市第一人民医院 耳鼻咽喉头颈外科，湖南 郴州 423000；3.湖南师范大学附属第一医院 耳鼻喉科，湖南 长沙 410005）

鼻内翻性乳头状 瘤（nasal inverted papilloma, NIP）是一种耳鼻喉科临床中常见的良性肿瘤，具有局部发病、侵袭性强、易复发且易恶性变的特点[1]。5%的NIP 与鼻窦癌有关，因此探讨NIP 的发病机制有助于其早期诊断及治疗。肺癌食管癌缺失基因1（deleted in lung and esophagi cancer 1,DLEC1）是一个新的候选肿瘤抑制基因，研究发现DLEC1基因是一个良好的预后指标[2]。而增殖细胞核抗原Ki-67 是一种与细胞有丝分裂密切相关的抗原，能敏感而特异且较全面可靠地反映人体细胞增殖活性[3]。本研究通过检测NIP组织中DLEC1表达及基因甲基化和Ki-67 的表达，探讨DLEC1与NIP 发病及临床病理特征的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月—2018年1月湖南师范大学附属第一医院（湖南省人民医院）及郴州市第一人民医院经病理确诊为鼻内翻性乳头状瘤患者30例为NIP组。其中，男性14 例，女性16 例；年龄39～67 岁，平均51.8 岁。另选取同期鼻中隔偏曲矫正术患者20 例为对照组，取其正常中鼻甲黏膜组织。其中，男性12 例，女性8 例。所有组织标本常规石蜡包埋切片备用。

1.2 方法

1.2.1 试剂 石蜡包埋组织DNA 提取试剂盒购自美国Omega 公司，引物、Taq 酶、Gold View Ⅱ型核酸染色剂等购自大连宝生物工程有限公司，EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司，即用型EnVisionTMSupper/HRP 检测试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

1.2.2 NIP 组织中DLEC1和Ki-67 检测 采用即用型EnVisionTMSupper/HRP检测试剂盒检测DLEC1和Ki-67 表达，操作步骤按试剂盒说明书进行。DLEC1在细胞核和/或细胞浆呈棕黄色为表达阳性，Ki-67 在细胞核呈棕黄色为表达阳性，于高倍显微镜下（×400）取5 个视野，依据染色细胞数及强弱分类及表达的细胞平均数所占百分比判定：＜5%为阴性，≥5%为阳性。

1.2.3DELC1甲基化检测 采用DNA 提取试剂盒提取石蜡包埋组织中DNA，采用EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒，将组织DNA 取1μg 进行修饰；以上游2 000 bp 作为该基因启动子区域设计引物，甲基化（M）引物序列，正向：5'-GATTATAGCGATGACGGGAT TC-3'，反向：5'-ACCCGACTAATAACGAAATTAACG- 3'；未甲基化（U）引物序列，正向：5'-TGATTATAGTGA TGATGGGATTTGA-3'，反向：5'-CCCAACTAATAACAA AATTAACACC-3'；扩增产物大小193 bp。PCR 反应 体系25 μl，反应条件根据文献修改[4]。甲基化：95℃ 预变性10 min，40 个循环（94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸5 min，4℃；非甲基化：95℃预变性10 min，40 个循环（94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸5 min，4℃。取扩增产物琼脂糖凝胶电泳判断结果。为保证检测可靠性，采用反复多次检测DLEC1均为甲基化阳性的肺腺癌A549 细胞DNA 为甲基化阳性对照，外周血单个核细胞DNA 标本为非甲基化阳性对照。产物电泳只出现非甲基化条带，结果统计为非甲基化；出现甲基化条带，则无论是否出现非甲基化条带，均统计为甲基化。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，计数资料采用例（%）表示，比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组DLEC1 和Ki-67 的表达情况

NIP 组DLEC1失表达23 例（76.7%），对照组DLEC1失表达9 例（45.0%），两组比较差异有统计学意义（χ2=5.223，P=0.022）；NIP 组Ki-67 阳性18 例（60.0%），对照组Ki-67 阳性2 例（10.0%），两组比较差异有统计学意义（χ2=12.500，P=0.000）。见图1。

图1 两组DLEC1 和Ki-67 的表达情况 （×400）

2.2 两组DLEC1 启动子甲基化水平

NIP 组DLEC1启动子区CpG 岛甲基化阳性检出率为43.3%（13 例），对照组有10.0%（2 例）DLEC1启动子区呈甲基化状态，两组比较，差异有统计学意义（χ2=6.349，P=0.012）。见图2。

2.3 NIP 组DLEC1 与Ki-67 表达的关系

NIP 组DLEC1与Ki-67 的表达有关（χ2=5.660，P=0.017）。见表1。

图2 两组DLEC1 基因启动子甲基化水平

表1 NIP 组DLEC1 与Ki-67 表达的相关性

3 讨论

NIP 在1854年被首次报道[5]，是一种鼻腔和鼻旁窦的良性肿瘤，它有3 个主要特点[6-7]：局部相对高侵袭性、高复发率及可能在发病初或复发时发现与恶性肿瘤相关。目前，肿瘤的性质及是否为鳞癌的癌前病变及发病机制仍不明确，这些特点使得其在临床治疗较为困难，因此对NIP 发病机制的研究具有重要的临床意义。

有研究[8-10]认为，其发病可能与HPV 感染有关，HPV 感染易引起组织细胞增殖，Ki-67 为增殖性核抗原标志物，在除G0期细胞，Ki-67 在所有G1、S、G2和M 期细胞中均有表达，且在许多恶性肿瘤中的表达多与肿瘤活跃、病理分期及早期复发有关。本研究中发现NIP 组Ki-67 表达高于对照组，与其他研究结果类似，说明在NIP 中存在组织增生。

许多标志物[11-12]如桥粒芯蛋白3 和表皮生长因子受体等与NIP 有关，但NIP 恶性转化的确切机制尚不清楚，有研究者[13]曾对口腔鳞癌及癌前病变黏膜白斑中DLEC1的表达及机制进行研究，发现DLEC1在口腔鳞癌中表达受抑制，且其抑制程度与肿瘤浸润深度相关。DLEC1表达从正常组织到黏膜白斑到鳞癌依次减弱。DLEC1[14]定位于3p22～p21.3，因已证实其在肝癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌、口腔鳞癌和肾细胞癌组织中表达下调，因而被鉴定为候选抑癌基因[15-18]。该基因包含37 个外显子，是一种相对较新的基因，其3p 位点是几个抑癌基因的著名位点。

DLEC1通过表观遗传改变而受抑制，其表达方式与表观遗传相关，受启动子CpG 高甲基化组蛋白有或无去乙酰化而被调控[19]。有研究在胃癌和结肠癌细胞系中再引入DLEC1可抑制肿瘤细胞克隆。而在多个肿瘤中发现DLEC1活性被抑制，可能是通过影响DLEC1启动子甲基化而实现[20]。其他研究[21]发现，在肝细胞癌中DLEC1可诱导细胞周期G1期阻滞，本研究发现NIP 组DLEC1失表达高于对照组，NIP 组DLEC1与Ki-67 表达有关，NIP 组DLEC1启动子区CpG 岛甲基化阳性检出率高于对照组，提示在NIP 中DLEC1基因受抑制，其发病可能与其有关。

综上所述，DLEC1表达缺失可能与NIP 的发病相关，通过DLEC1启动子区CpG 岛甲基化造成基因在NIP 中失表达，并与Ki-67 协同，引起NIP 组织异常增殖而发病。DLEC1可能成为治疗NIP 并防止其复发的新的治疗靶点。