PGPR复合菌系对花生生长及根际土壤微生物的影响

刘 畅，黄文茂，韩丽珍,2*

(1.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室, 贵州 贵阳 550025)

【研究意义】化肥的使用是农作物获得高产的重要手段之一，但过度施用又会导致生态环境恶化，不利于农业的可持续发展。土壤微生物在土壤无机、有机营养物质的生物地球化学循环以及维持土壤健康和品质方面都起着非常重要的作用[1]。以有益微生物为主的新型生物肥的研究与应用日益受到世界各国的重视[2]。【前人研究进展】植物根际是根系表面和贴近根周围的狭窄区域，是土壤、根系及微生物三者相互作用的区域[3]，根际中的相互作用在土壤有限养分的转化和溶解等方面发挥着关键作用。植物根部与根际有益微生物的互作是植物健康和土壤肥力的决定因素。在植物根际环境中定植的细菌即为“根际细菌”[4]，从植物根际土壤中分离出的有益细菌往往具有促进植物生长和提高产量的作用，这类细菌被称为植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)[5]。迄今为止，研究发现的根际促生菌的促生作用不尽相同，其促生机理尚未完全确定。多数植物根系促生菌的促生效果基于植株-土壤-微生物互作，即通过生物固氮、增加根际营养物质有效性、诱导根表面积增加等达到对植物的促生目的[6]。植物根际促生菌既能通过溶磷、生物固氮及解钾直接发挥促生作用，也可通过活跃土壤微生物生态系统而间接促进植物生长。【本研究切入点】目前已有大量根际促生菌分离及植物促生试验的报道，但鲜有促生菌对植株-土壤-微生物整个体系影响的研究。前期已经在茶树根际土壤中分离、筛选得到4株分属不同种属的根际促生菌：P9为束村氏属、P10为伯克霍尔德氏菌属、GD3为假单胞菌属及GD12为芽孢杆菌属，初步研究表明，P9和P10菌株是具溶磷固氮能力的优良促生菌菌株，GD3和GD12具有解钾能力，且GD12也有一定的固氮性能[7-8]。【拟解决的关键问题】花生是我国重要的油料作物，种植面积仅次于油菜和大豆[9]。为促进植物根际促生菌在花生生产上应用，以具溶磷固氮功能的P9和P10菌株为主体菌株，分别与具解钾能力的GD3和GD12两两组合配制成兼有固氮、溶磷、解钾功能的复合菌系，通过对花生幼苗进行灌根处理，测定不同处理组花生的生理及生长性状、花生土壤的氮磷钾含量，监测根际土壤的功能菌群数及土壤酶活性，从植物-土壤-微生物的角度综合分析复合菌系对花生的促生机理，旨在为下一步利用这4株根际促生菌制备菌肥提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤采集 土壤均来源于贵州省贵阳市花溪区贵州大学南校区(N26°42′48″，E106°67′31″)，取样地海拔1114 m，取距离土壤表面20～30 cm的壤土，将采集的土壤过筛(<2 mm)灭菌后用于盆栽试验。土壤理化指标：pH 5.47，有机质29.01 g/kg，全氮176 g/kg，全磷0.518 g/kg，碱解氮 346 mg/kg，速效钾262 mg/kg，有效铁8.47 mg/kg。

1.1.2 供试菌株 4株植物根际促生菌均从茶树根际分离得到，分别为GD3(假单胞菌属，Pseudomonashunanensis)、GD12(芽孢杆菌属，Bacillusflexus)、P9(束村氏属，Tsukamurellasp.)和P10(伯克霍尔德氏菌属，Burkholderiasp.)[7-8]。

1.1.3 供试作物 供试花生选用贵州本地花生，市购。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 以具有溶磷固氮功能的P9和P10菌株为主体菌株，分别与具有解钾能力的GD3和GD12两两组合配制成兼有固氮、溶磷、解钾功能的4个复合菌系处理组，即P9+GD3、P9+GD12、P10+GD3和P10+GD12，开展PGPR复合菌系对花生生长及根际土壤微生物影响的盆栽试验。

1.2.2 复合菌系制备 供试菌株P9、P10、GD3和GD12分别活化后，接种于LB液体培养基中摇床振荡培养24 h，用无菌水调节OD600=1.0的菌悬液。按试验设计，等体积混合不同菌株菌悬液以制备复合菌系备用。

1.2.3 盆栽试验 试验于2017年7月14日开始，将花生种子用20 %过氧化氢溶液浸泡20 min进行表面消毒，无菌水多次冲洗后置于30 ℃恒温培养箱中培养3 d，待种子生根后，将其转入盆中；待生长1周后，选取长势相近的花生幼苗用于试验。盆栽试验设置4个复合菌系处理组及1个对照组，每组6株幼苗。处理组每隔2 d用菌液灌根1次，每次5 mL；对照组每隔2 d施5 mL LB培养基。常规管理30 d后收集幼苗植株、花生根际土壤分别进行测定。

1.2.4 植株生理生长指标及土壤理化性质测定 测定花生幼苗生长指标包括的株高、鲜重等。生理指标选择叶绿素含量，采用Arnon法测定。土壤理化性质包括有机质、全氮、碱解氮、全磷、速效钾及有效铁，分别采用重铬酸钾氧化容量法、凯氏法、碱解扩散法、钼锑抗比色法、火焰分光光度法及原子光谱法进行测定。

1.2.5 根际土壤功能菌群数测定 功能菌群主要涉及氮循环相关功能菌群、溶磷菌以及解钾菌等，其中，氮循环功能菌群选择了氨化细菌、硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌及自生固氮菌，分别以蛋白胨氨化培养基、亚硝酸氧化细菌培养基、氨氧化细菌培养基、硝酸还原培养基以及阿须贝无氮培养基进行培养[10-11]，无机溶磷菌采用NBRIP培养基培养[12]，解钾菌采用亚历山大硅酸盐培养基培养[13]。固氮菌、溶磷菌及解钾菌的计数采用稀释涂布平板法，氨化细菌、硝化细菌、亚硝化细菌和反硝化细菌的计数采用最大或然值法[14]。

1.2.6 根际土壤酶活的测定 根际土壤中脲酶、过氧化氢酶酶活测定采用关松荫的方法[15]，蔗糖酶活测定采用魏元的方法[16]，中性磷酸酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的酶活测定参照吴金水的方法[14]。

1.3 统计处理

数据分析采用SPSS 20.0进行LSR法多重比较。

2 结果与分析

2.1 PGPR复合菌系对花生幼苗生长的影响

从表1看出，经PGPR复合菌系灌根处理的花生幼苗株高显著高于对照(P<0.05)，其中P9+GD3、P9+GD12、P10+GD3和P10+GD12处理的株高分别较对照高27.40 %、24.88 %、35.27 %和37.60 %，P10+GD12处理的花生株高显著高于P9与GD3及GD12组合的处理。在不同复合菌系处理间花生幼苗鲜重差异不显著，但均显著高于对照(P<0.05)。此外，复合菌系处理与对照的花生植株叶绿素含量差异不显著。综合花生幼苗生理及生长情况，PGPR复合菌系对花生生长具有促进作用，尤其以P10+GD12处理的促生效果最明显，其次为P10+GD3菌系处理。说明，P10菌株的促生作用优于P9菌株。

2.2 PGPR复合菌系对花生土壤养分的影响

对不同处理土壤的理化性质进行测定发现， 4个PGPR复合菌系处理的速效钾含量显著高于对照(P<0.05)，其中，P10+GD3和P10+GD12处理土壤的速效钾含量分别比对照高1.56和1.38倍。PGPR复合菌系处理的土壤氮含量有一定程度的提高，P10+GD3和P10+GD12处理的全氮和碱解氮含量显著高于对照(P<0.05)，其中，碱解氮含量P10+GD3和P10+GD12处理分别较对照高64.36 %和43.40 %，全氮含量分别比对照高25 %和21 %。此外，经4个复合菌系处理后，土壤有机质、全磷和有效铁含量较对照均有不同程度提高，但差异不明显。说明PGPR复合菌系处理能明显提高土壤氮、钾营养水平，其中以P10为主体菌株的组合处理优于P9菌株的组合。

表1 不同PGPR复合菌系处理的花生幼苗生理生长指标

注：同列不同小写字母表示不同处理间差异水平显著(P<0.05)，下同。

Note: Different letters in the same column indicate significant difference at 5 % level. The same as below.

表2 不同PGPR复合菌系处理的花生土壤理化性质

表3 不同PGPR复合菌系处理的花生根际土壤功能菌群数量

2.3 PGPR复合菌系对花生根际土壤功能菌群的影响

氮循环相关的功能菌群包括氨化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌及自身固氮菌。从表3看出，P10+GD12处理花生根际土壤氮循环功能菌群除固氮菌外均显著高于P9+GD12、P9+GD3和CK处理(P<0.05)，氨化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌及反硝化细菌的数量分别较对照高36.98、22.09、39.67及15.56倍。自身固氮菌以P9+GD12处理组最高，而P10+GD12处理的自身固氮菌数量较对照高8.25倍(P<0.05)。

测定结果显示，解磷菌数量P10+GD3处理与对照相比差异显著，P10+GD3处理较对照高7.71倍(P<0.05)；其他处理组的解磷菌数量均高于对照，但差异不显著。复合菌系处理显著提高根际土壤中解钾菌数量，尤以P10+GD12处理组最明显，较对照高13.23倍(P<0.05)。

2.4 PGPR复合菌系对花生根际土壤酶活的影响

PGPR复合菌系处理使根际土壤酶活性发生改变。从图1看出，复合菌系浇灌后，根际土壤中的脲酶酶活较对照显著增高，其中以P10+GD3的处理效果最佳，较对照高2.48倍，并显著高于其余处理。过氧化氢酶酶活复合菌系处理较对照均显著提高，其中P10+GD12的组合最明显，较对照提高1.74倍。蔗糖酶活除P10+GD3处理较对照显著增高外，其余处理较对照均有所降低，但差异不显著。磷酸酶包括中性、酸性和碱性磷酸酶，测定结果表明，酸性磷酸酶活性最高，中性磷酸酶次之，碱性磷酸酶活性最低。碱性磷酸酶活PGPR复合菌系处理与对照无明显差异；中性、酸性磷酸酶酶活以P10+GD12处理最高，显著高于其余处理。

小写字母表示显著水平(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant difference at 5 % level图1 不同PGPR复合菌系处理的花生根际土壤酶活性Fig.1 Enzyme activities of peanut rhizosphere soil treated with different compound flora

3 讨 论

目前对于根际促生菌的研究主要关注根际促生菌自身的促生作用及菌株的生理特征[17]。王同等[18]报道利用茶园土中筛选到的溶磷菌苏云金芽孢杆菌B1，接种花生发现可以很好地在土壤中定殖，并显著提高土壤有效磷含量。从披碱草根际土壤分离到具固氮活性的003PWXZ6菌株，接种披碱草后显著促进其株高和生物量，且在根际有一定的定殖能力[19]。目前，综合分析根际促生菌对于植物的促生影响、对土壤肥力指标的提高、对土壤特定功能微生物及土壤酶活性影响的研究仍很少。土壤微生物作为土壤的重要生物因子，在为植物提供养分过程中起着关键作用，其可通过改变植物根系生理和根际环境，直接影响植物获得养分的能力，而非根际土壤中的养分循环如生物固定和矿化分解、硝化和反硝化等过程都离不开微生物的参与。土壤微生物是土壤肥力形成和持续发展的核心动力[20]，参与土壤氮循环的微生物主要有氨化细菌、自生固氮菌、亚硝化细菌、硝化细菌和反硝化细菌，可以调节和平衡氮元素在土壤中的转化[21]。其中，含氮有机物如蛋白质、尿素、尿酸及核酸等经氨化细菌的氨化作用而产生的氨对提供农作物氮素营养十分重要[22]，自生固氮菌进行的生物固氮是土壤中有效性氮素的最主要来源[23]，磷和钾以无机或有机状态存在于土壤中，无法被植物直接吸收，大量的难溶性磷钾甚至导致土壤结构恶化[24]。解磷菌和解钾菌则可将不溶性磷和钾转换为可供植物吸收的可溶性磷和速效钾，改善土壤结构，甚至提高作物的抗病性[25]。研究表明，在花生生长过程中施用PGPR复合菌系后，根际土壤中包括自生固氮菌、氨化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌和反硝化细菌的氮循环功能菌群、解磷菌和解钾菌数量均有不同程度的提高，表现出促生菌处理使土壤微生物活动更为活跃。邱勤等[26]利用PGPR菌(包括根瘤菌、联合固氮菌、硅酸盐细菌和巨大芽孢杆菌)接种紫花苜蓿后显著增加土壤细菌、真菌、放线菌、根瘤菌、硅酸盐细菌和固氮菌数量，土壤基本化学肥力指标明显提高。

土壤酶活性反映土壤养分的转化能力及总生物活性，是评价土壤肥力的重要指标，可在一定程度上反映土壤的健康状况[27]。脲酶酶促产物氨是植物氮源之—，直接参与土壤氮素循环，与土壤有机质含量及微生物数量有关[28]。过氧化氢酶通过促过氧化氢的分解有利于防止其对生物体的毒害作用，其酶活活性与土壤有机质含量有关[29]。蔗糖酶对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氯、磷含量、微生物数量及土壤呼吸强度有关[30]。磷酸酶参与土壤中有机磷的转化，与土壤碳、氮及有机磷含量相关[31]。吕雅悠等[32]利用普城沙雷菌A21-4接种辣椒后显著提高辣椒植株茎粗，根际土壤过氧化氢酶、脲酶和磷酸酶活性显著提高，土壤速效氮磷钾含量较对照有不同程度的增加，根际土壤细菌和放线菌数量增加，真菌数量降低。试验结果表明，花生幼苗接种PGPR复合菌系后除蔗糖酶活性和中性磷酸酶活性变化不明显外，接种组的脲酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶均较对照有不同程度的提高，微生物活跃代谢也是土壤中氮、钾含量显著提高的原因。

研究表明，根际促生菌复合菌系的加入不仅直接促进花生幼苗的生长，同时导致根际土壤中的功能菌群结构、酶活甚至土壤理化性质的改变。有研究发现，作物生长旺盛期的根系土壤中解磷菌数量明显高于其他时期[33]，表明作物的生理活动也会影响根际土壤中微生物群落的改变。显然，PGPR复合菌系对花生幼苗的促生是植株-微生物-土壤整个体系相互作用的结果，对这一体系的进一步研究将极大地帮助理解根际促生菌对于植株的促生原理，对于不同作物土壤、菌肥的选择都有现实指导意义。

4 结 论

研究以具溶磷固氮的Tsukamurellasp. P9和Burkholderiasp. P10为主体菌株，分别与具有解钾能力的PseudomonashunanensisGD3及BacillusflexusGD12两两组合，获得同时兼有解钾、解磷和固氮作用的4个PGPR复合菌系P9+GD3、P9+GD12、P10+GD3和P10+GD12。花生幼苗的盆栽试验显示，经4个复合菌系灌根的处理均可促进花生的生长，这种促生作用是通过提高土壤的氮磷钾含量，促进土壤氮循环菌群、溶磷菌及解钾菌等功能微生物的活化、促进土壤脲酶、过氧化氢酶和中性磷酸酶的水平而发挥效应的，尤以P10+GD12复合菌系组合表现出最强的促生效应。与对照(未进行PGPR复合菌系处理)相比，P10+GD12复合菌系处理的花生株高和鲜重分别提高37.60 %和63.90 %，土壤碱解氮和速效钾提高64.36 %和1.38倍，根际土壤的氨化细菌、自生固氮菌及解钾菌分别增加36.98、8.25和13.23倍，根际土壤脲酶增加2.48倍。因此，利用根际促生菌的功能构建多功能复合菌系可有效促进花生幼苗生长，提高土壤养分含量，改善根际土壤环境，为下一步复合菌剂的应用奠定理论基础。