ctDNA在转移性去势抵抗性前列腺癌诊断中的应用现状

在世界范围内，前列腺癌是男性第二大常见恶性肿瘤及导致癌症相关性死亡的第五大原因[1]，在美国其发病率位居男性恶性肿瘤首位[2]。雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy，ADT）是晚期前列腺癌的重要治疗手段，但几乎所有患者经治疗后都会进展为转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）[3]，预后极差。虽然诊治水平不断进步，但mCRPC仍不可治愈，迫切需有更新的方法用于诊治及监测等。

近年来在mCRPC中，对于循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）进行了深入研究。ctDNA是从原发肿瘤、循环肿瘤细胞或转移性肿瘤中释放到血液的单链或双链DNA，含有与原始肿瘤细胞相同的基因组成和异质性[4]，可作为独特的遗传标记或生物标志物，是一种具有广泛应用前景的工具。本文将对ctDNA在mCRPC中的检测及应用于耐药机制和病情监测等研究进展进行综述。

1 ctDNA概述

无论肿瘤细胞还是正常细胞，其脱落到循环系统的DNA均称为无细胞DNA（cell-free DNA，cfDNA），ctDNA则是从肿瘤细胞脱落到循环系统的cfDNA，长度一般不超过200个碱基对[5]，其确切的起源和释放机制尚不完全清楚，目前主要认为与肿瘤细胞凋亡、坏死及肿瘤细胞的分泌释放有关。根据肿瘤类型、肿瘤负荷或肿瘤分期的不同，在血液中发现ctDNA占cfDNA的比例为0.01%～90.00%，半衰期平均为2 h[6]。检测血浆中ctDNA，可识别原发肿瘤中存在的点突变、拷贝数变异以及染色体和表观遗传学改变[7]。此外，基于ctDNA获取便捷、样本来源充足、可重复进行检测等特点，可作为恶性肿瘤研究中具有巨大应用潜力的工具。

2 mCRPC中ctDNA检测

2.1 ctDNA检测情况和基因组变化

ctDNA是通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）方法，如BEAMing、ARMS-PCR、微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR），或二代测序（next generation sequencing，NGS）方法检测到的，几种常见检测方法的特点见表1，2。

表1 基于PCR检测ctDNA的方法比较

表2 基于NGS检测ctDNA的方法比较

在mCRPC患者中，ctDNA含量及可检测性高，在75%患者中ctDNA分数（ctDNA在cfDNA中的比例）＞2%，约50%患者ctDNA分数＞30%[8-9]，利用包括比较基因组杂交和单基因二代测序技术，可在75%以上的患者中检测出ctDNA[10]。

Sonpavde等[11]研究发现，mCRPC患者的ctDNA改变主要包括非同义突变和扩增，其中最常见的复发性体细胞突变基因包括TP53占36%、雄激素受体（androgen receptor，AR）占22%、腺瘤性息肉病杆菌（adenomatous polyposis coli，APC）占10%、神经纤维蛋白1（neurofibromin 1，NF1）占9%，拷贝数增加最常见基因包括AR占30%、MYC占20%和BRAF占18%。Hahn等[12]进一步检测了患者在治疗过程中ctDNA基因组的变化，发现ctDNA改变主要为核苷酸变异、拷贝数变异、插入/删除、融合以及重新排列。该研究对未接受新治疗的患者间隔1年进行检测，结果显示基因组结构并未随时间推移而出现显著性差异，与此相反，接受过1次新治疗的患者出现更多的基因组改变，说明患者的ctDNA基因组结构随着治疗的改变发生变化。

2.2 ctDNA与转移性肿瘤组织活检的一致性

组织活检可明确转移病灶、获取体细胞基因组特征，但通常是对单个转移部位进行活检，不能解决克隆异质性的问题。骨骼是mCRPC最常见的转移部位，但骨组织活检困难，不能获得足量的肿瘤DNA，临床效益并不高。检测ctDNA能充分了解肿瘤内部异质性，其结果也不会与转移病灶的组织活检相混淆。因此，ctDNA有望取代组织活检，但两者检测到的基因组改变保持一致是必要的前提。有研究表明[10，13]，mCRPC患者的cfDNA（可看作ctDNA粗略的替代品）突变或拷贝数变异与转移病灶的体细胞基因组结构具有一致性。Wyatt等[8]对前列腺癌患者的ctDNA研究发现，对ctDNA中的72个临床相关基因进行靶向测序，与转移病灶组织的外显子测序数据进行比较，结果显示转移病灶组织中出现的所有体细胞突变同时存在于ctDNA中，对于一些关键驱动基因突变，如AR、SPOP、TP53等，两者的一致性超过90%，此外共享突变的变体等位基因层次结构在两者之间也高度相似。在另一个类似的研究中[12]，ctDNA与转移病灶组织的基因组改变一致率高达96%。因此，ctDNA检测可识别转移病灶组织中的基因组改变，取代组织活检成为更好的工具。

3 在mCRPC中ctDNA的应用

3.1 患者耐药性机制中的ctDNA研究

阿比特龙和恩杂鲁胺是mCRPC患者的首选药物，但20%～40%患者在治疗初期就表现出耐药性，并且所有患者均不可避免地出现获得性耐药[14]。AR基因改变是患者产生耐药性的主要机制，如AR扩增和突变、AR共激活或共抑制修饰、AR剪接变异体等[15]，mCRPC患者ctDNA中的AR基因改变易于检测[8，11]，因此可借助ctDNA研究mCRPC的耐药性。

Romanel等[16]研究发现，ctDNA中检测到AR突变（包括L702H和T878A）或拷贝数增加的患者对阿比特龙疗效较差，ctDNA中这些AR基因的改变可预测患者的耐药性；与Azad等[17]的研究结论相一致，在对阿比特龙和恩杂鲁胺产生耐药的患者中，ctDNA可检测到AR基因的拷贝数增加和突变。Annala等[18]研究还发现，产生耐药性患者的ctDNA外显子3'携带截断的AR基因配体结构域，证实ctDNA中AR基因的截断与原发性耐药有关。但有研究表明[19]，ctDNA中的AR基因扩增并不排除良好的疗效，意味着AR扩增与耐药性的关系仍需进一步证实。通过ctDNA研究mCRPC的耐药机制具有可行性，目前主要集中于AR基因的研究。因mCRPC的相关基因非常广泛，耐药机制复杂多样，仍需对在耐药机制中ctDNA的应用进行深入研究，未来有望利用ctDNA发现新的靶向药物，克服患者的耐药性，改善预后。

3.2 ctDNA对患者疾病进展及预后的监测

mCRPC患者在疾病进展及接受治疗的过程中，ctDNA的定量及基因组特征均可发生改变。研究表明，高浓度的ctDNA和高ctDNA分数与患者预后不良及总体肿瘤负荷指数相关[16]。治疗后ctDNA的下降程度亦与预后有关，行AR导向治疗患者的ctDNA分数比基线或疾病进展时更低，这部分患者表现出更好的预后，并且治疗前ctDNA分数较低的患者预后最好[18]。一项对转移性前列腺癌患者进行奥拉帕尼治疗的TOPARP-A研究表明，治疗8周后cfDNA（作为ctDNA的替代品）下降50%以上的患者，无进展生存期和总生存期明显延长[20]。ctDNA中较高数量的基因改变也预示着患者较差的预后，尤其是AR基因[11]，但AR基因改变主要导致治疗耐药性的发生，这可能是造成较差预后的主要原因。ctDNA也可在前列腺癌转移时发生变化，伴有骨转移的患者[19]，以及在新发转移性前列腺癌尤其是内脏转移的患者中[21]，ctDNA分数明显升高。长期以来，mCRPC最主要的监测指标是前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA），但PSA存在一些局限，如肿瘤Gleason评分较高或患者进入晚期阶段时，PSA数值与肿瘤负荷相关性不高[22]，敏感性和肿瘤特异性并不能达到100%，结果可能受感染或炎症干扰等。ctDNA作为监测疾病进展及预后的工具，相比于PSA，其半衰期短，检测结果所受干扰小，能及时反映与病情相关的基因信息，准确性高，可作为全新的生物标志物。

4 结语

目前，ctDNA应用于mCRPC尚未广泛纳入临床实践，主要仍集中于基因组分析及耐药性机制研究。ctDNA还可用于疾病发生发展机制的研究，或用于前列腺癌的早期筛查和诊断以及开发新的治疗手段。主要挑战在于ctDNA的检测率、NGS及ddPCR等技术检测的敏感性仍不足以充分应用于临床，特别是在疾病早期阶段，ctDNA的检测率可能较低。此外，昂贵的价格也是这些技术投入使用所面临的难题。