湘西黄牛Y-SNPs遗传多样性研究

蔡翠翠， 宁庆庆， 陈秋明， 祝远魁， 陈宁博， 陈 宏， 雷初朝*

(1.宁夏农林科学院固原分院，宁夏 固原 756000；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；3.湖南天华实业有限公司，湖南 涟源 417126)

中国黄牛根据外貌特征、地域分布和遗传学特点被分为三大类型：北方黄牛(黄河以北地区)、中原黄牛(黄河以南至长江以北地区)和南方黄牛(长江以南地区)。湘西黄牛属于湖南省湘西地区独有的黄牛品种，主要分布在湖南省湘西土家族苗族自治州，为巫陵牛品种的一个重要组成部分，并于2012年通过国家商标局注册评审获得“湘西黄牛”地理标志商标[1]。湘西黄牛主要分布于湖南省的凤凰、桑植、永顺、慈利、花垣等县，具有体质结实、肢蹄强健、耐劳耐寒、抗湿耐粗饲等优良特性[2-3]。湘西黄牛作为肉役兼用型黄牛品种，其养殖产业化能够促进湘西肉牛产业的发展，其分子遗传研究对开发利用和保护湘西黄牛遗传资源有很重要的意义。

动物的Y染色体的非重组区(MSY区)遵循父系单向遗传，且Y染色体单倍型完整、突变率低、不易受重组和回复突变等因素影响，是进化事件的忠实记录者，故此为家牛的起源进化、遗传多样性和群体遗传结构等研究的重要工具[4]。近年来，Y染色体单核苷酸多态性(Y-SNPs)作为第3代分子遗传标记被广泛用于动物遗传多样性和动物起源进化方面研究[5]。研究发现，全世界的家牛有3种Y染色体单倍型组，分别为普通牛Y1和Y2单倍型组以及瘤牛Y3单倍型组[5]。Ginja等[6]利用3个Y-SNPs(DDX3Y、UTY-19和ZFY)标记对13个葡萄牙本地牛品种的遗传多态性进行分析，发现葡萄牙牛中有荷斯坦牛的血统，也揭示了其单倍型以及与地理分布和表型特征的关系。Li等[7]利用4个Y-SNPs(ZFY9、ZFY10、UTY19和USP9Y)对中国16个北方、中原和南方黄牛品种的Y染色体单倍型进行分析，发现北方黄牛中普通牛Y2单倍型组占91.4%，南方黄牛中瘤牛Y3单倍型组占90.8%，而中原黄牛含有普通牛Y2和瘤牛Y3两种混合单倍型组；从Y2和Y3单倍型组频率可看出中国黄牛的地理分布规律，即从北方到南方雄性瘤牛血统渗入比例越来越高。

姚一博等[8]利用湘西黄牛线粒体DNA D-loop区序列分析了其母系遗传及遗传多样性，但有关湘西黄牛Y染色体的父系起源、遗传多样性和种群遗传结构至今未见报道。因此，本研究利用2个Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)标记对湘西黄牛的父系起源、遗传多样性和群体遗传结构进行探究，以期为今后开展湘西黄牛的分子育种和资源保种工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 采样及基因组DNA提取

在湖南省湘西州凤凰县湘西黄牛保种场采集24头湘西黄牛公牛耳组织样，放于75%的酒精带回实验室低温保存。采用常规酚—氯仿抽提法对其基因组DNA进行提取，稀释至10～20 ng/μL保存备用。

1.2 引物合成和PCR扩增

参照已发表的家牛Y染色体2个Y-SNPs标记[5-7](UTY-19和ZFY-10)合成2对引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反应体系(12.5 μL)：2×EsTaqMasterMix(Dye) 6.25 μL，ddH20 4.75 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.25 μL，模板DNA 1 μL。

PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，54 ℃(见表1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环；72 ℃充分延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶(含Goldview核酸染料)电泳后，凝胶成像系统检测，将检测合格的产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。

1.3 PCR产物测序和单倍型分析

将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司，用3730XL型DNA测序仪进行正、反向测序，测序结果通过Chromas 2.6.5软件进行查看和校正，获得每头湘西黄牛公牛的2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)测序结果，统计每个个体的单倍型组，再用Arlequin 3.11软件计算单倍型多样度。

表1 家牛2个Y-SNPs标记的相关信息

2 结果与分析

通过对24头湘西黄牛公牛的2个Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)多态性标记测序进行分析，结果显示：UTY-19标记的碱基存在C和A两种SNPs，频率分别为12.5%和87.5%；ZFY-10标记的碱基也存在C和T两种SNPs，频率分别为12.5%和87.5%；通过试验数据整理分析，发现UTY-19和ZFY-10标记SNPs中的C与A和C与T相对应，并确定湘西黄牛的单倍型组。根据Gotherstrom等[5]和Ginja等[6]对Y染色体单倍型的判定标准，湘西黄牛有Y1和Y3两种单倍型组(表2)。其中3头湘西黄牛公牛属于普通牛Y1单倍型组，频率为12.5%(3/24)；21头湘西黄牛公牛属于瘤牛Y3单倍型组，频率为87.5%(21/24)，表明湘西黄牛可能有普通牛和瘤牛2种父系起源并以瘤牛起源为主，且其地域分布属于南方黄牛类型，这与中国南方黄牛的起源进化相一致。湘西黄牛的Y染色体单倍型多样度为0.2283±0.0978，表明遗传多样性相对较低，品种纯度较高。

表2 湘西黄牛Y染色体单倍型与单倍型频率

3 讨 论

Y染色体核苷酸多态性(Y-SNPs)作为第3代分子遗传标记已被广泛用于动物的父系起源、遗传多样性、群体遗传结构等方面[9-13]。常振华等[9]利用4个Y-SNPs(DDX3Y-7、UTY-19、ZFY-9和ZFY-10)标记分析了我国16个地方黄牛品种的Y染色体遗传多样性，结果显示中国黄牛存在Y2和Y3两种单倍型组，且自北到南Y2单倍型组频率逐渐降低，而Y3单倍型组频率逐渐增加。Xia等[10]对我国34个地方黄牛品种进行Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)多态性标记分析，表明中国黄牛存在普通牛Y2和瘤牛Y3两种单倍型组，其中在中国北方和中原地区Y2单倍型组占优势，而在南方地区Y3单倍型组占优势。赵晓诚等[11]对30头岭南黄牛公牛的2个Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)多态性标记进行分析，发现岭南黄牛中存在普通牛Y2和瘤牛Y3两种单倍型组，但以瘤牛Y3单倍型组为主(93.33%)。马志杰等[12]对62头柴达木黄牛公牛的2个Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)进行多态性分析，发现柴达木黄牛公牛有Y1(21%)和Y2(79%)两种普通牛单倍型组。姚一博等[8]等通过对33头湘西黄牛mtDNA D-loop区全序列分析，共检测到55个变异位点并确定了15个mtDNA单倍型，通过构建系统发育树发现，湘西黄牛有普通牛和瘤牛两种母系起源，受瘤牛影响更大。

本研究以24头湘西黄牛公牛为对象，同样采用2个Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)多态性标记分析方法，确定了湘西黄牛有普通牛Y1和瘤牛Y3两种单倍型组，其中瘤牛Y3单倍型组占主导地位(87.5%)，说明湘西黄牛主要是瘤牛父系起源，与中国黄牛的地理分布规律[7,9-11]基本一致。本研究发现湘西黄牛的Y-SNP遗传多样度为0.2283±0.0978，低于Edwards[14]等报道的138个国外牛品种的平均Y染色体单倍型多样度0.422±0.300，表明湘西黄牛具有较低的父系遗传多样性和较高的品种纯度。本研究发现湘西黄牛有欧洲牛Y1单倍型组的血统，也解释了近20年来为了提高湘西黄牛的生产效率而引入欧美优良品种(如安格斯牛、短角牛)杂交改良使得群体遗传结构发生变化的现象[1]。由于中国地方黄牛Y1单倍型组的概率很低，说明中国地方黄牛Y1单倍型组很可能是引进欧美商品肉牛品种，如安格斯牛与短角牛等[7,9-11]。因此，本研究推测湘西黄牛中的Y1单倍型组很可能是与安格斯牛或短角牛所致[1]。为了避免湘西黄牛遗传资源的流失，建议进一步加强湘西黄牛保种区和保种场中湘西黄牛的纯种选育、提高和保护，以期为今后开展湘西黄牛的分子育种、资源开发利用工作提供种质来源。