隆林黄牛Y-SNPs遗传多样性与起源研究

宣泽义， 曹艳红， 贾 鹏， 陈少梅， 雷初朝*

(1.广西壮族自治区畜牧研究所，南宁 530001；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

黄牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛。中国黄牛具有广阔的遗传基础和丰富的遗传变异，起源上包括普通牛(Bostaurus)和瘤牛(Bosindicus)2个牛种，二者的共同祖先是原牛(Bosprimigenius)。利用位于Y染色体雄性特异区(MSY)的单核苷酸多态性(Y-SNPs)标记可以确定牛的Y染色体单倍型组(即普通牛Y1和Y2单倍型组，瘤牛Y3单倍型组)，对阐明黄牛的遗传多样性、群体结构以及父系起源发挥了重要作用[1]。

哺乳动物Y染色体由雄性特异区(MSY)和拟常染色体区(PAR)两部分组成，其中MSY区在减数分裂时不与X染色体发生重组[2-3]，具有父系遗传特性，突变率低，有完整的单倍型，且不受重组和回复突变的影响，是研究动物父系起源与迁徙路线的重要工具。根据Y染色体的形态特点，可以将中国地方黄牛Y染色体分为3大类：(1)北方黄牛均为中部着丝粒Y染色体，为普通牛起源；(2)南方黄牛均为端部着丝粒Y染色体，属于瘤牛起源；(3)中原黄牛存在中部和端部着丝粒Y染色体，属于普通牛与瘤牛的混合起源[4-5]。

隆林黄牛是广西三大良种黄牛之一，是在喀斯特地貌环境和植物群落条件下，经过长期风土驯化、选育形成的广西优良地方黄牛品种，其主要产地为广西隆林县、西林县和田林县，并于1982年载入《广西畜牧品种调查汇编》。隆林黄牛体躯较高大，发育匀称，肌肉发达，性情温驯，疾病少，耐粗饲、耐劳、耐热、耐寒，适应性好，肉质细嫩、屠宰率较高、胴体中肌肉比例大，是较理想的役、肉兼用牛，但其存在生长速度缓慢、泌乳量低，以及斜尻、四肢姿势欠正的缺点[6]。过去选种选配工作落后，致使隆林黄牛某些生产性能出现退化趋势，近年来为提高隆林牛的各项生产性能，曾引进一些外来黄牛品种进行杂交。目前关于隆林黄牛品种Y染色体遗传多样性及父系起源的研究较少。本研究利用2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)对20头隆林黄牛公牛进行多态性检测，通过分析隆林黄牛Y染色体的单倍型组成，来探明该品种的遗传多样性、群体遗传结构及父系起源，为开展该品种的分子育种和资源保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 采样及基因组DNA提取

在广西隆林县随机采集20头隆林黄牛公牛的耳组织样品，低温保存带回实验室，常规酚—氯仿法提取基因组DNA，稀释浓度至10～20 ng/μL，保存备用。

1.2 引物合成和PCR扩增

参照Ginja等[7]报道的2个家牛Y-SNPs标记(即UTY-19和ZFY-10)合成2对引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。25 μL PCR体系：2×PrimeSTAR Max Premix(上海宝生物公司)12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，双蒸水10.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃终延伸8 min，后冷却至4 ℃保存。PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶(含GoldView核酸染料)电泳后，凝胶成像系统拍照检测。将检测合格的PCR扩增产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序分析。

表1 隆林黄牛2个Y-SNPs标记的PCR片段大小、退火温度与引物序列

1.3 引物合成和PCR扩增

将UTY-19和ZFY-10的测序结果用Seqman v7.1软件进行对比分析，找出相应的SNP位点，并进行基因型分型，用ARLEQUIN v3.0软件计算单倍型多样度(H±SD)。

2 结果与分析

通过对20头隆林黄牛公牛的2个Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)标记的测序分析，UTY-19标记分型结果显示，隆林黄牛中未发现C碱基，仅存在A碱基；ZFY-10标记分型结果显示，隆林黄牛中存在C碱基和T碱基。结合表2可知，隆林黄牛存在Y2和Y3两种单倍型组，无Y1单倍型组，即隆林黄牛存在瘤牛和普通牛2个父系起源。在所检测的20头隆林黄牛公牛中有14头为Y3单倍型组(70%)，有6头为Y2单倍型组(30%)，单倍型多样度为0.4421±0.0875。

表2 黄牛Y-SNPs单倍型及起源

3 讨 论

父系遗传的Y-SNPs标记分析为研究动物起源、驯化历史和迁徙路线提供了重要的理论支持。在世界现存的家牛品种中，一共有3种Y染色体单倍型组，分别是普通牛的Y1和Y2单倍型组，瘤牛的Y3单倍型组，Y1单倍型组在欧亚大陆北部分布广泛，Y2单倍型组主要集中于中东和欧洲南部，而中国黄牛大部分品种都是Y2和Y3单倍型组，只有少部分品种存在Y1单倍型组[8-9]。Li等[10]对16个中国地方黄牛品种共302头公牛的4个Y-SNPs标记(DDX3Y-7、ZFY-9、ZFY-10和UTY-19)和2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)进行多态性分析，结果发现中国黄牛中有极少量个体含有Y1单倍型组，推测中国黄牛中低频率的Y1单倍型组可能是由于外来肉牛和奶牛品种的杂交所致，中国地方黄牛品种中原本没有Y1单倍型组，这是区分中国地方黄牛品种遗传资源的一个重要标记。侯佳雯等[11]对皖南牛的父系起源进行的相关研究显示，皖南牛属于南方黄牛类型，以瘤牛的种质特性为主。李秀良等[12]对涠洲牛2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)及2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)进行多态性检测，结果显示涠洲牛属于瘤牛父系起源。在本研究中，对隆林黄牛的2个Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)进行了父系遗传分析，结果显示，隆林黄牛存在普通牛Y2单倍型组和瘤牛Y3单倍型组两种单倍型组，且以瘤牛Y3单倍型组为主，表明隆林黄牛是以瘤牛父系起源为主，普通牛父系起源为辅，这与之前在皖南牛和涠洲牛等中国南方黄牛上的研究结果相一致。本研究结果显示，隆林黄牛的单倍型多样度为0.4421±0.0875，高于国外牛品种的Y染色体单倍型多样度平均值(0.422±0.3)[13]，这表明隆林黄牛的Y染色体遗传多样度相对较高，为隆林黄牛的遗传资源保护和利用，及相关选种选育工作提供了科学依据。隆林黄牛是广西壮族自治区的重要黄牛品种之一，根据地域分布属于南方黄牛即瘤牛类型，由于不断引进中国北方黄牛及国外肉牛品种进行杂交，导致隆林黄牛以Y3单倍型组为主，并且存在部分Y2单倍型组，这与中国南方黄牛的起源进化和实际选育情况是一致的。