TERT基因单核苷酸多态性与年龄相关性黄斑变性的关联研究

李宝华，刘 平，王 新

0引言

年龄相关性黄斑变性(ARMD)是严重威胁老年人身体健康的一种重要疾病。随着年龄的增加，视网膜色素上皮细胞和神经视网膜发生退行性病变，造成不可逆性视力下降或丧失。ARMD在西方国家已成为第一位致盲性眼病，在亚洲其发病率亦逐渐增多[1]。因其病因不明，目前仍未找到阻止其病程进展的有效方法，因此临床中加强该病的诊断与治疗对于降低其发病率，提高预后效果具有重要的研究意义。

端粒是位于真核生物染色体末端的核蛋白复合体，其主要作用是保证染色体完整和基因组稳定性。端粒长度进行性缩短最终可导致细胞分裂停止，迫使细胞衰老及死亡[2]。已有研究发现端粒长度与ARMD发病之间存在一定关联[3]。端粒酶的活化是端粒长度维持或延长的主要机制，端粒酶逆转录酶(TERT)是端粒酶催化亚基，可通过合成染色体末端DNA而延长端粒，致使细胞异常增殖甚至永生化[4]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是基因组中重要的遗传变异之一，已有研究发现TERT基因遗传变异与冠心病、肺癌、肾癌等多种重大疾病发生密切相关[5-7]，而目前TERT基因SNP与ARMD发病风险的关联仍未见报道。基于此，本文通过高通量遗传变异基因分型技术，探讨TERT基因SNP与ARMD患者发病风险的相关性，评估其作为ARMD患者早期诊断新型分子标志物的可行性。

1对象和方法

1.1对象选取2017-03/2019-01于我院眼科就诊并确诊为ARMD的患者191例为病例组，其中男101例，女90例；年龄68.0±4.6岁。纳入标准：(1)经眼底血管荧光造影及OCT检查确诊为ARMD；(2)年龄不小于45岁；(3)均为汉族。排除患有除ARMD以外的其它眼部疾病，既往有眼外伤史、眼部手术史，合并高血压、心血管疾病、糖尿病、肿瘤等全身性疾病患者。选取同期来我院体检的健康体检者197例为对照组，其中男109例，女88例；年龄67.1±6.0岁。两组受检者性别构成、年龄相匹配，差异无统计学意义(χ2=0.235，P=0.628；t=1.618，P=0.107)。本研究经过本院伦理委员会审查通过，所有受检者均同意参加本研究并签署知情同意书。

表1 TERT基因SNP等位基因基因型与ARMD发病风险的关联

SNP编号基因区域等位基因型MAF病例组对照组PaOR(95%CI)Pbrs2075786内含子A/G0.1650.1600.9991.03(0.85～1.25)0.767rs10069690内含子C/T0.1990.1400.7891.24(1.02～1.50)0.029rs2242652内含子G/A0.2040.1750.1491.10(0.92～1.31)0.319rs2853677内含子A/G0.3720.3650.9781.01(0.87～1.17)0.873rs2853676内含子C/T0.1780.1550.9261.08(0.90～1.31)0.415rs2736098外显子C/T0.3870.3810.7431.01(0.87～1.17)0.892rs2736122内含子G/A0.0810.0760.6861.04(0.80～1.35)0.774

注：a：Hardy-Weinberg平衡分析P值；b：非条件性Logistic回归计算P值，并通过年龄和性别校正。

1.2方法

1.2.1血样DNA提取采集受检者空腹静脉血4mL，分离血浆后，进行血细胞DNA提取(全血基因组小量抽提试剂盒，北京百泰克生物技术有限公司)，操作步骤按照试剂盒说明书进行，定量后标记并置于-80℃冰箱冻存备用。

1.2.2 SNP位点选择和基因分型通过PubMed数据库筛选目前已报道的TERT基因中与端粒长度相关的SNP位点作为候选SNP位点[6，8-9]，并且在中国汉族人群中次等位基因型频率>0.05，候选位点中连锁不平衡相关程度>0.8的位点只保留1个，最终选择7个位点(rs2075786、rs10069690、rs2242652、rs2853677、rs2853676、rs2736098、rs2736122)进行基因分型。基因分型实验采用Sequenom Mass Array高通量技术平台(Sequenom Inc.，San Diego，CA，USA)完成。

2结果

2.1 TERT基因SNP不同等位基因型与ARMD发病风险的关联对照组受检者7个SNP位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05，表1)。分析每个位点不同等位基因型人群的ARMD发病风险发现，rs10069690等位基因型为T型的人群与C型相比发病风险显著提高[OR(95%CI)=1.24(1.02～1.50)，P=0.029]，其它位点不同等位基因型与ARMD发病风险无显著相关性。

表2 TERT基因SNP不同基因型的人群分布 例

2.2 TERT基因SNP不同基因型的人群分布进一步分析每个SNP位点3种基因型在两组受检者中的分布发现，SNP位点rs10069690突变基因型(CT、TT)在病例组的比例显著高于对照组(P=0.03，表2)，其它位点3种基因型的人群分布在两组间无显著差异。

2.3 TERT基因SNP位点rs10069690基因型与ARMD发病风险的关联利用最常用的3种遗传模型进一步对SNP位点rs10069690不同基因型与ARMD发病风险的关联进行分析发现，显性模型得到结果最为显著，即与rs10069690野生型(CC)人群相比，包含突变型(CT+TT)的人群ARMD发病风险提高了63%[OR(95%CI)=1.63(1.05～2.53)，P=0.03]，通过隐性模型分析，纯合突变型人群(TT)与野生型及杂合型人群相比，ARMD发病风险无显著差异，见表3。

3讨论

本研究通过已发表文献筛选出TERT基因中7个与端粒长度存在关联的SNP位点，利用基因分型技术和统计学分析首次发现SNP位点rs10069690不同基因型与ARMD发病风险存在显著关联，包含突变基因型的人群发病风险显著提高，其它位点在本研究中未观察到与ARMD发病风险相关的证据。

表3 TERT基因SNP位点rs10069690基因型与ARMD发病风险的关联 例

注：a：非条件性Logistic回归计算P值，并通过年龄和性别校正。

TERT基因位于人类染色体5p15.33，作为端粒酶的核心组成部分，是调节端粒酶活性的关键[10]。已有大量研究发现TERT基因SNP与多种疾病发生及进展密切相关，尤其在肿瘤研究领域，多项研究发现TERT基因SNP与肿瘤密切关系，然而与ARMD的相关性仍未见报道。Duan等[11]通过病例对照研究发现TERT基因SNP位点rs2853676与胃癌发病风险升高有关。另有研究发现，SNP位点rs2853677与非小细胞肺癌及肺腺癌易感性密切相关[6，12]。而在本研究中，rs2853676和rs2853677与ARMD发病风险无显著相关性。SNP位点rs2736098位于TERT基因第二外显子上，国内外多项研究表明rs2736098多态性与膀胱癌易感性相关。Rafnar等[13]通过全基因组关联研究发现rs2736098与欧洲人群膀胱癌易感性密切相关。另一项研究发现，TERT基因rs2736098位点多态性与美国洛杉矶人群膀胱癌易感性无关，而与中国上海人群膀胱癌易感性相关[14]。本研究中rs2736098多态性与ARMD发病无显著关联。也有研究发现rs2242652与黑色素瘤发病风险密切相关[15]。

SNP位点rs10069690位于TERT基因第四内含子，目前已发现rs10069690基因型与乳腺癌、胶质瘤、卵巢癌等多种肿瘤发病或预后密切相关[16-19]，提示该位点在疾病发生及进展中可能发挥一定作用。本研究首次证实了rs10069690与ARMD发病风险密切相关，但其具体机制仍需进一步研究。我们推测SNP位点rs10069690不同基因型可能通过影响TERT基因表达活性，从而改变端粒长度促进ARMD发生。虽然rs10069690位点位于基因内含子区，但极有可能通过强连锁的SNP位点发挥基因表达调控作用，因此rs10069690不同基因型影响ARMD发生的功能机制有待进一步开展。

ARMD是一种衰老相关疾病，目前对ARMD的治疗主要是阻止早期ARMD向晚期ARMD的发展，而对于晚期ARMD的治疗手段有限，因此识别ARMD的危险因素对于ARMD的早期预防及延缓进展具有重要意义，找到可以用于ARMD临床诊断的遗传变异标志物仍需筛选新的位点以及大样本量研究验证。